青蒿琥酯對肺癌A549細胞侵襲能力及ICAM-1、MMP-9表達的影響

陳獻珊 韓坤元 陳鋒夏 吳從明 黃偉煒

肺癌占全球癌癥死亡的首位。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌總數超過80%，容易發生侵襲和轉移，多數患者死于轉移和復發。深入了解肺癌侵襲轉移機制，并探討其防治策略尤為必要。近年來研究[1,2]發現青蒿素及其衍生物除了具有抗瘧作用外，對多種腫瘤細胞在體外具有殺傷或抑制作用，但其作用機制尚不十分清楚。多項研究[3,4]證實青蒿素衍生物之一—青蒿琥酯可抑制肺癌細胞增殖，并誘導其凋亡。本研究繼續觀察低濃度青蒿琥酯對肺癌A549細胞侵襲轉移能力的影響和對細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）蛋白表達的影響，以期為NSCLC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物及試劑 人NSCLC A549細胞株購于中南大學腫瘤研究所。SPF級BALB/C-nu/nu品系裸鼠購于中科院上海實驗動物中心。青蒿琥酯購于桂林南藥股份有限公司（批準文號H-10930195），用5%碳酸氫鈉注射液溶解超濾除菌后，再用RPMI-1640培養液稀釋成不同終濃度備用。RPMI-1640培養基和胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司。胰蛋白酶、MTT（噻唑藍）和DMSO（二甲基亞砜）購于美國Sigma公司。Transwell侵襲小室購自美國Costar公司。ICAM-1和MMP-9兔多抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養 將A549細胞用RPMI-1640培養液培養，內含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL。置于37oC、5%CO2、飽和濕度環境下培養。

1.3 MTT實驗 取對數生長期的A549細胞，調細胞濃度為2×105個/mL，以每孔200 μL接種于96孔板，每組6復孔。分別加入終濃度為0 μg/L、1.25 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L和20 μg/L的青蒿琥酯50 μL， 置37oC、5%CO2培養箱中培養24 h。離心去上清，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，37oC培養4 h后，加入現配的DMSO，振蕩溶解，酶標儀測570 nm處吸光度。計算細胞增殖抑制率。

1.4 Transwell小室體外侵襲實驗 取對數生長期的A549細胞，分別加0 μg/L、1.25 μg/L、2.5 μg/L和5 μg/L的青蒿琥酯作用24 h，胰蛋白酶消化，調細胞濃度為2×105個/mL，各組分別吸取200 μL接種于上層小室，將其置于滅菌的24孔板。下室加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養液。常規培養24 h。將上室面的Matrigel和細胞用濕棉簽擦掉，膜用甲醇固定10 min，蘇木精染色，高倍鏡下計數穿過微孔膜的細胞數。每組細胞隨機計數10個視野，求其平均值。實驗重復3次。

1.5 裸鼠A549細胞移植瘤生長抑制實驗 于裸鼠右后肢皮下接種A549細胞0.2 mL（約含活細胞數1×106個），約1周后長出腫塊。取已成瘤小鼠20只，隨機分成4組。參考文獻[5]分別腹腔注射低濃度青蒿琥酯10、20和40 mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。每日1次，連續注射14天。于最后一次給藥治療12 h后無痛處死小鼠，取出移植瘤并稱重。計算抑瘤率。

1.6 Western blot實驗 分別將各組移植瘤標本勻漿，提取總蛋白，蛋白定量，取15 μL樣品加入等體積2×上樣緩沖液，煮沸5 min備用。取100 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉液孵育2 h，加入相應一抗4oC過夜（β-actin為內參），漂洗后與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，化學發光顯色。IPP光密度分析軟件進行目的條帶的表達檢測及分析。

1.7 統計學方法 實驗數據以Mean±SD表示，采用SPSS 16.0統計軟件，兩均數比較經方差齊性檢驗后，方差齊者用t檢驗。多組間數值資料比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿琥酯對A549細胞的增殖抑制作用 青蒿琥酯對A549細胞的生長具有抑制作用。青蒿琥酯終濃度＞5 μg/L時，對A549細胞生長抑制作用明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）；青蒿琥酯終濃度≤5 μg/L時，在24 h內對A549細胞的生長無明顯毒性作用，差異無統計學意義（P＞0.05），A549細胞存活率超過90%（表1）。后續Transwell小室體外侵襲實驗采用較低濃度青蒿琥酯（≤5 μg/L）。

2.2 青蒿琥酯抑制A549細胞侵襲轉移 Transwell體外侵襲實驗結果顯示，與對照組穿過小室的細胞數（96.33±6.41）相比，青蒿琥酯1.25 μg/L組、2.5 μg/L組及5 μg/L組的侵襲轉移細胞數明顯減少，分別為（75.43±4.37）（P＜0.05）、（61.43±3.61）（P＜0.01）和（39.31±3.41）（P＜0.01）（圖1）。

2.3 青蒿琥酯對裸鼠A549細胞移植瘤的影響 經低濃度青蒿琥酯處理后，各劑量組移植瘤瘤重均較對照組減輕。其中青蒿琥酯20 mg/kg組（0.52±0.05）g和40 mg/kg組（0.37±0.03）g的瘤重與對照組（0.69±0.05）g相比有統計學差異（P＜0.01）；10 mg/kg青蒿琥酯組瘤重（0.62±0.04）g與對照組相比無統計學差異（P＞0.05）（圖2）。隨青蒿琥酯劑量的增加，對移植瘤的抑制率有增大趨勢。各劑量組的抑瘤率分別為8.69%（10 mg/kg組）、24.74%（20 mg/kg組）和43.09%（40 mg/kg組）。

2.4 青蒿琥酯對裸鼠A549細胞移植瘤ICAM-1和MMP-9蛋白表達影響 Western印跡結果顯示，經青蒿琥酯處理后，10 mg/kg青蒿琥酯組即開始出現ICAM-1和MMP-9蛋白表達量降低。與對照組相比，ICAM-1蛋白表達分別降低16.67%（10 mg/kg組）、40.48%（20 mg/kg 組）和58.91%（40 mg/kg組）；MMP-9蛋白表達分別降低21.05%（10 mg/kg組）、41.52%（20 mg/kg組）和66.31%（40 mg/kg組），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

表 1 青蒿琥酯對A549細胞增殖率的影響（Mean±SD, n＝6）Tab 1 The proliferation-inhibiting effect of artesunate on A549 cells (Mean±SD, n＝6)

圖 1 不同濃度青蒿琥酯對肺癌A548細胞侵襲、遷移的影響。A：0 μg/L青蒿琥酯組；B：1.25 μg/L青蒿琥酯組；C：2.5 μg/L青蒿琥酯組；D：5 μg/L青蒿琥酯組。Fig 1 Effects of artesunate with different doses on migration and invasion of lung cancer A459 cells. A: 0 μg/L artesunate group; B: 1.25 μg/L artesunate group; C: 2.5 μg/L artesunate group; D: 5 μg/L artesunate group.

3 討論

青蒿素是我國科學家開發的具有完全知識產權的抗瘧藥。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物之一，具有更好的水溶性和抗瘧效果。研究[2,6]表明青蒿素及其衍生物除有抗瘧作用外，還具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等生物學作用。目前青蒿素及其衍生物表現出的強大抗腫瘤活性越來越引起國內外學者注意。美國癌癥協會的研究[1]表明：青蒿琥酯對結腸癌細胞、白血病細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞等55種惡性腫瘤細胞具有細胞毒性作用。多項研究[3,4]亦證實青蒿琥酯可以劑量依賴方式抑制體外培養的肺癌細胞增殖，并誘導其凋亡。本研究以較低濃度青蒿琥酯作用于裸鼠A549細胞移植瘤模型，觀察青蒿琥酯對A549細胞的體內抗瘤效應。結果發現較低濃度的青蒿琥酯即對移植瘤有一定抑制作用。進一步提示青蒿琥酯可能是一種潛在的抗肺癌藥物選擇。

腫瘤的侵襲和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。NSCLC轉移復發率更是居于原發性惡性腫瘤的前列。從分子水平深入了解肺癌侵襲轉移機制，并探討其防治策略尤為必要。腫瘤的侵襲轉移是一個多階段的復雜過程，從分子水平可概括為粘附、蛋白降解和移動三個步驟。腫瘤細胞首先粘著于細胞外基質、血管內皮、靶器官細胞等處。然后分泌水解酶，降解和破壞細胞外基質及毛細血管基底膜等。突破限制后浸入周圍組織器官或進入血循環或淋巴系統，最終形成轉移灶。目前關于青蒿琥酯對惡性腫瘤細胞侵襲轉移能力影響較少有報道。在炎癥、纖維化等的研究[7-9]中發現，青蒿琥酯具有調節蛋白水解酶表達，影響細胞外基質合成及降解的作用。鑒于此，本研究首先通過體外實驗，得到青蒿琥酯對A549細胞增殖抑制作用的濃度范圍，然后以較低濃度青蒿琥酯進行Transwell小室侵襲實驗，觀察較低濃度青蒿琥酯對體外培養的肺癌A549細胞侵襲能力的影響。結果發現A549細胞侵襲能力隨著青蒿琥酯濃度增加而逐漸降低。提示青蒿琥酯對肺癌細胞的抑制作用可能也與其降低肺癌細胞侵襲能力有關。

圖 2 不同劑量青蒿琥酯對A549細胞移植瘤瘤重影響（Mean±SD, n＝5）（*P＜0.01, 與對照組比較）Fig 2 The effect of artesunate with different doses on the heavy of A549 cell xenograft tumor (Mean±SD, n＝5) (*P＜0.01, when compared with control group)

圖 3 不同劑量青蒿琥酯對A549細胞移植瘤ICAM-1和MMP-9蛋白表達影響（Mean±SD, n=6）（*P＜0.05, 與對照組比較）Fig 3 The effect of artesunate with different doses on the ICAM-1 and MMP-9 expression in A549 cell xenograft tumor (Mean±SD, n=6) ( *P＜0.05,when compared with control group)

ICAM-1和MMP-9是腫瘤細胞侵襲轉移過程中非常重要的兩個細胞因子。ICAM-1表達于腫瘤細胞膜表面，介導腫瘤細胞-內皮細胞、腫瘤細胞-細胞外基質的粘附；同時也介導腫瘤細胞-淋巴細胞粘附，使腫瘤細胞易于隨淋巴細胞遷移進入血循環或淋巴循環，增加腫瘤遷移浸潤的機會。ICAM-1在多種類型的腫瘤組織中存在異常表達[10]。針對NSCLC患者的研究[11,12]發現，ICAM-1在NSCLC組織中高表達，且其表達量與肺癌不同分期、侵襲轉移和病理類型等密切相關。本研究亦證實在體內A549細胞移植瘤中存在ICAM-1高表達。提示ICAM-1與肺癌的侵襲轉移密切相關。MMPs是降解細胞外基質最重要的酶類，同時還具有促進腫瘤血管生成的作用。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，可降解細胞外基質及基底膜的主要結構蛋白IV型膠原，在膠質瘤、胃癌、結腸癌等多種侵襲性強的惡性腫瘤中高表達。臨床研究發現，MMP-9不光高度表達于肺癌組織中，在患者血清水平亦存在顯著升高，是NSCLC患者早期診斷和預后判斷的重要參考指標[13,14]。抑制體外培養的H1299肺癌細胞MMP-9表達，則能抑制其早期轉移[15]。本研究亦發現在體內A549細胞移植瘤中存在MMP-9高表達。鑒于ICAM-1和MMP-9與肺癌侵襲轉移的密切關系，本研究觀察了較低濃度青蒿琥酯對A549細胞裸鼠皮下移植瘤內ICAM-1和MMP-9表達的影響。結果發現較低濃度青蒿琥酯（10 mg/kg）即可下調移植瘤內ICAM-1和MMP-9表達量，提示青蒿琥酯對肺癌細胞侵襲能力的影響可能與其抑制ICAM-1和MMP-9表達有關。