組織因子途徑抑制物-2在宮頸癌中表達情況的研究分析

孟斐

宮頸癌是全世界婦女中僅次于乳腺癌導致婦女死亡的第二大惡性腫瘤，在中國女性中發病率居第一位。宮頸癌的形成是一個漸進的變化過程，一般要經過鱗狀上皮不典型增生、原位癌發展到浸潤癌，其主要特點是早期蔓延。目前對宮頸癌的治療包括手術、放療、化療等，但仍有大量的患者復發而死亡，因此隨著對腫瘤發生發展分子機制研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當前腫瘤研究的熱點。組織因子途徑抑制物-2(Tissue factor pathway inhibitor2，TFPI-2)，最初從胎盤組織中分離出來，又稱胎盤蛋白-5(placental protein 5，PP5)。目前來說TFPI-2在生理、病理中的作用還沒有準確完整結論，但在許多方面已經有了使人感興趣的進展，已有研究發現，在許多類型的人類腫瘤細胞中，如胃癌［1］，結腸癌［2］，前列腺癌［3］等，都存在編碼TFPI-2基因的抑制及缺失，值得進一步的研究。本文主要檢測TFPI-2在宮頸癌中的表達情況，現分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2011年1月在沈陽醫學院奉天醫院婦產科門診及住院患者手術切除標本共115例，臨床資料完整。患者年齡范圍26～71歲，中位年齡(45.5士2.3)歲。其中宮頸癌50例，CIN50例和婦科疾病行子宮切除術的正常宮頸標本15例。宮頸癌分期采用FIGO2000年的臨床分期標準，組織病理分級按FIGO分級方法評定。3組患者一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 ①石蠟切片在病理科完成。②常規脫蠟水化:二甲苯20min，3次:100%酒精3次，各10min:98%酒精10 min;80%酒精10min:70%酒精10min。③蒸餾水沖洗，PBS洗5min×3次。④熱修復抗原:切片浸入0.01M構椽酸緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5min，反復兩次。室溫冷卻。⑤PBS洗5min×3次。⑥3%H2O237℃孵育20min，以阻斷內源性酶活性。⑦ PBS洗5min×3。⑧滴加A試劑山羊血清室溫15min。⑨除去多余液體，不洗。⑩實驗組加入一抗抗體((TFPI-2工作濃度分別為1∶160)，對照組用PBS代替一抗，4℃濕盒過夜。?取出濕盒，復溫后PBS洗5min×3次。?滴加試劑 B生物素化二抗工作液 IgG37℃15 min，PBS洗5min×3次。?滴加試劑C辣根標記鏈霉卵白素工作液37℃ 15min，PBS 洗5min ×3 次。?DAB(棕色)顯色，1.5ml蒸餾水中加入試劑盒中A，B，C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制染色程度。?蘇木素復染15～30s，清水沖洗，返藍。?系列脫水:70%酒精5min，80%酒精5min，98%酒精5min，100%酒精5min×3，二甲苯5 min×3。

1.3 統計學方法 統計學處理采用SPSS13.0軟件包進行分析。檢測數據以均數±標準差(±s)表示，兩組間比較進行t檢驗，當P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達 正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌中TFPI-2表達逐漸降低，三者間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

2.2 TFPI-2表達與宮頸癌臨床病理關系 宮頸癌組織中TFPI-2表達水平與宮頸癌的FIGO分期及淋巴結轉移有關，差異有統計學意義(P＜0.05)。但是與宮頸癌的分化程度及病理類型之間差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達

表2 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達

3 討論

組織因子途徑抑制物-2(Tissuefactorpathwayinhibitor2，TFPI-2)，最初從胎盤組織中分離出來，又稱胎盤蛋白-5(placentalprotein5，PP5)。定位于7號染色體，確切位置是7q22，體內主要以相對分子質量為32000的形式存在于內皮細胞和成纖維細胞的細胞外基質(ECM)中。TFPI-2分子共由5個部分組成，即富含酸性氨基酸的N端、3個首尾相連的Kunitz結構域和富含堿性氨基酸的C端。TFPI-2通過Kunitz結構域對蛋白水解酶進行抑制，主要是KD1結構域和P1殘基與蛋白水解酶的蛋白袋結構(主要是精氨酸和賴氨酸殘端)結合來抑制其活性。KD1的三維結構是典型的Kuntiz蛋白酶抑制劑折疊結構，其核心區域含有抑制多種絲氨酸蛋白酶的結構元件。反應活性部位的P1殘基(Arg224)與纖溶酶等多種絲氨酸蛋白酶活性位點結合，從而直接抑制酶的作用［4］。TFPI-2屬于庫尼(Kunitz)型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白，是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，在體外可強烈抑制纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、血漿激肽釋放酶、FXa及基質金屬蛋白酶(MMPs)等［5］。因此可能與組織發生、胚胎發育分化、傷口愈合、纖溶以及腫瘤的侵襲轉移等生理和病理過程有關。

目前國內外關于TFPI-2在宮頸癌中的研究并不多見，華盛頓大學的Pavel等［6］在235個基因中篩選宮頸癌甲基化基因，研究發現TFPI-2在宮頸癌組織及宮頸癌細胞株HeLa、Si-Ha、CaSki中存在高甲基化狀態，利用5-雜氮2-脫氧核苷酸(5-aza-2'-deoxyc-ytidine，DAC)解除甲基化后，TFPI-2可以恢復表達。由此推測TFPI-2失活可能與宮頸癌的侵襲、轉移有關，但是目前關于TFPI-2對宮頸癌細胞侵襲、轉移能力影響的相關研究尚未見報道，因此尚有待進一步研究證實。

本組資料中我們采用免疫組化法對宮頸癌、CIN及正常宮頸上皮中TFPI-2的表達進行檢測發現，該基因主要表達在正常宮頸上皮細胞以及癌細胞中，在宮頸癌中的表達以陰性和弱陽性為主，在正常宮頸組織中主要以強陽性為主，在C1N中的表達介于宮頸癌和正常宮頸上皮組織之間，三者間差異具有統計學意義，提示宮頸癌中存在TFPI-2表達下降及缺失，TFPI-2的表達水平隨著宮頸病變的進展呈下降趨勢，因此推測，TFPI-2的表達下調在正常宮頸上皮進展為宮頸癌癌前病變甚至宮頸癌的過程中起著一定的作用。

此外，我們進一步分析了TFPI-2的表達與宮頸癌患者臨床病理參數的關系，發現其表達的下降趨勢與宮頸癌FIGO分期及淋巴結轉移有關。表明腫瘤越晚期，TFPI-2表達水平越低，提示TFPI-2表達降低可能與宮頸癌的不良預后相關。我們推測TFPI-2的低表達在宮頸癌的發生發展中起重要作用。

［1］Takada H，Wakabayashi N，Dohi O，et al.Tissue factor pathwayinhibitor 2(TFPI2)is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cance.Cancer Genet Cytogenet，2010，197(1):16-24.

［2］Ribarska T，Ingenwerth M，Goering W，et al.Epigenetic inactivation of the placentally imprinted tumor suppressor gene TFPI2 in prostate carcinoma.Cancer Genomics Proteomics，2010，7(2):51-60.

［3］Gl?ckner SC，Dhir M，Yi JM，et al.Methylation of TFPI2 in stool DNA:a potential novel biomarker for the detection of colorectal cancer.Cancer Res，2009;69(11):4691-9.

［4］Chand HS，Schmidt AE，Bajaj SPet al.Structure function analysis of the reacti-ve site in the first Kunitz type domain of human tissue factor pathway inhibitor-2.Biol Chem，2004，279(17):17500-7.

［5］Du X，Chand H S，Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix met alloproteinase-1.Biochim Biophys Acta，2003，1621(3):242-245.

［6］Pavel S，Qinghua F，Gary G，et al.Discovery of Novel Methylation Biomarkers in Cervical Carcinoma by Global Demethylation and Microarray Analysis.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2006;15(1):114-23.