新疆漢族冠心病患者內皮型一氧化氮合酶基因G894T多態性

江雪萍 徐艷萍 楊忠偉 肖 白 馮秀麗 (新疆生產建設兵團農七師醫院心內科，新疆 奎屯 833200)

冠心病是由遺傳和環境因素共同作用所致的復雜疾病，發病過程與多基因之間和基因-環境之間的相互作用等有關，可能存在多個與冠心病相關的基因，這些基因單個起作用或聯合作用，還可能與傳統易感因素共同作用而增加冠心病的危險性。我們應用聚合酶鏈反應(PCR)-限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)檢測了新疆82例漢族正常個體和42例冠心病患者eNOS基因G894T突變的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機抽取124例新疆地區無血緣關系的漢族正常人群和漢族冠心病患者的靜脈血各3 ml，EDTA.K2抗凝，充分混勻后放入－20℃冰箱冷藏室保存待檢。漢族正常人群經檢查已排除冠心病、高血壓、糖尿病及腦血管病。82例中男47例，女35例，年齡18～62歲;漢族冠心病人42例，其中男31例，女11例，年齡30～79歲。漢族冠心病人均符合1979年WHO冠心病診斷標準且心電圖檢查均為陳舊性心肌梗死患者。

1.2 主要儀器 Master cycler Reppendorf PCR儀(梯度核酸擴增儀)，購自上海艾本德生物技術國際貿易有限公司;2.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色、上海生物工程有限公司試劑盒。UVP AC暗箱+GEL相機凝膠成像儀，購自天美有限公司。

1.3 DNA的提取 常規酚抽提法提取基因組DNA。BioRad紫外分光光度計測定DNA濃度并標化至100 ng/μl。

1.4 多聚合酶鏈反應檢測eNOS基因G894T多態性 ①引物設計與合成參照文獻〔1〕設計引物:上游引物5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3';下游引物:5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3';② PCR擴增:反應體系為25 μl，包括 DNA模板 1.0 μl、10 × 緩沖液 (Mg2+)2.5 μl，dNTP Mix 2.0 μl，正義鏈引物 0.2 μl，反義鏈引物 0.2 μl Taq 酶 0.2 μl，純凈水 18.9 μl;③PCR儀擴增反應條件:預變性為95℃ 2 min，變性95℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共37個循環，最后72℃延伸5 min。擴增后的PCR產物為248 bp，經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，100 V，30 min，置凝膠成像儀上觀察特異性條帶，打印并記錄了實驗結果;④基因型檢測:限制性酶切反應體系10 μl，包括 PCR 產物 8.4 μl、10 × 緩沖液 1 μl、BaⅡ內切酶(大連寶提供)0.6 μl，37℃酶切2 h終止。酶切產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像，觀察基因型。

1.5 統計學分析 計算新疆漢族正常人群和冠心病患者兩組基因型頻率和等位基因頻率，經過Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗，表明各基因型頻率已達遺傳平衡，具有群體代表性。各組間頻率比較用χ2檢驗。

2 結果

2.1 電泳結果 G等位基因存在BanⅡ酶切位點，而T等位基因沒有BanⅡ酶切位點。因此GG基因型酶切產物為163和85 bp，GT基因型具有248和163 bp，TT基因型酶切產物為248 bp，結果見圖1、圖2。

圖1 漢族正常人群PCR產物及經BanⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

圖2 漢族冠心病人PCR產物及經BanⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2 新疆漢族正常人群eNOS基因頻率 在82例樣品中，GG型69例，GT型10例，TT型3例，三種基因型的頻率分別為0.84、0.12、0.04，G 和 T 等位基因分布頻率分別為 0.90、0.10。經χ2檢驗，這些比例與 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.166 4，P＞0.05)，具有群體代表性。等位基因頻率分布男女間無顯著性差異(χ2=0.004 1，P ＞0.05)，見表1。

表1 新疆漢族正常人群eNOS基因型及等位基因頻率分布

2.3 新疆漢族冠心病人eNOS基因頻率 在42例樣品中，GG型32例，GT型6例，TT型4例，三種基因型的頻率分別為0.76、0.14、0.10，G 和 T 等位基因的頻率分別為 0.83、0.17。經χ2檢驗，這些比例與 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.305 7，P＞0.05)，具有群體代表性。等位基因頻率分布男女間無顯著性差異(χ2=0.024 6，P＞0.05)。見表2。

表2 新疆漢族冠心病人eNOS基因型及等位基因頻率分布

2.4 新疆漢族82例正常人群與42例冠心病人eNOS基因G894T多態性GG、GT、TT及G和T等位基因分布頻率比較，新疆漢族冠心病人eNOS基因G894T多態性有GG基因型頻率下降，TT基因型頻率升高趨勢，但與漢族正常人相比差異不顯著(χ2=1.532 8，P＞0.05)。而G和T等位基因頻率分布也有上述趨勢，但差異不顯著(χ2=0.682 1，P＞0.05)。見表3。

3 討論

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關鍵酶，eNOS催化生成的NO具有舒張血管、調節血流、抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移和清除超氧自由基、抑制血小板聚集、黏附和白細胞的趨化激活等重要功能，是心血管系統抗動脈粥樣硬化、防止血栓形成和維持正常血管舒縮反應中必不可少的保護因子〔2〕。有研究發現eNOS基因第7外顯子中的G894T突變和冠心病的發病及心肌梗死的風險有關〔3，4〕。Colombo 等〔5〕的研究顯示G894T錯義突變與意大利人冠心病的存在和嚴重程度相關。eNOS基因分布不同，存在種族差異〔6〕。本研究發現新疆漢族冠心病人中存在eNOS基因G894T多態性GG基因型頻率下降，TT基因型頻率升高趨勢，G和T等位基因頻率分布也有上述趨勢，但與漢族正常人差異不顯著，可能與年齡差異以及樣本量小有關，目前還不能完全排除新疆漢族冠心病的發生與eNOS基因G894T突變的相關性，有待進一步研究。

1 Adam V，Benjafield D，Brain J.Morris association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene in essential hypertension J〔J〕.Am J Hypertension，2000;13:994-8.

2 Lefer AM.Nitric oxide nature's naturally occurring leukocyte inhibitor〔J〕.Circulation，1997;95(3):553-4.

3 Lee WH，Hwang TH，Oh GT，et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean males〔J〕.Vasc Med，2001;6:103-8.

4 唐歐杉，徐 耕，秦豐明，等.內皮型一氧化氮合酶基因多態性和早發冠心病的相關性研究〔J〕.嶺南心血管病雜志，2004;10:293-6.

5 Colombo MG，Andreassi MG，Paradossi U，et al.Evidence for association of a common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene(Glu298 Asp polymorphism)to the presence extent and severity of coronary artery disease〔J〕.Heart，2002;87(6):525-8.

6 Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension〔J〕.Hypertension，1998;32:38.