凋亡相關基因bax在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

劉瑞芬 蔣軍廣 張曉燕 楊 超 孫 曼 史 江

(鄭州大學第一附屬醫院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

肺癌是當前發病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一。研究表明，細胞凋亡在肺癌的發生、發展中起著重要作用。但哪些基因、蛋白與肺癌細胞凋亡及預后密切相關尚需進一步研究。bax基因為bcl-2基因家族中的重要一員，多與bcl-2形成二聚體共同調節細胞凋亡。本文主要研究bax在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及與細胞凋亡的關系，以期為NSCLC的早期診斷、治療和評估預后提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 對象 隨機選取鄭大一附院病理科2009～2011年外科切除的NSCLC標本60例，年齡36～87歲，所有病人在術前均未接受化、放療，病理診斷明確。其中男40例，女20例;鱗癌30例，腺癌30例;高分化15例，中、低分化45例;按照美國聯合癌癥分類委員會和國際抗癌聯盟制定的標準，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和Ⅳ期共21例;有淋巴結轉移者27例，無淋巴結轉移者33例;有胸腔積液者11例，無胸腔積液者49例。另設20例對照組，為癌旁正常組織(經病理證實)，所有標本均為蠟塊包埋，由專業人員切片，每例3片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗-Caspase-3(Active)、兔抗-bax均購于北京博奧森生物技術公司;凋亡試劑盒購于美國羅氏公司;SP9000試劑盒、DAB試劑盒，購自北京中杉生物工程公司。

1.2.2 免疫組化染色 將隨機所選的60例肺癌組織及20例正常對照組織交由病理科切片，切完后隨即放入60℃烤箱內烘烤3小時，切片脫蠟至水，將切片放入裝有抗原修復液的缸子中，放入微波爐高溫5 min，低溫10 min后取出進行抗原修復，過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性;非免疫性動物血清阻斷非特異性反應;滴加一抗;加生物素標記的二抗;滴加辣根酶標記卵霉鏈白素;DAB顯色;蘇木素復染;梯度酒精脫水;中性樹膠封片。

1.2.3 細胞凋亡的檢測 將切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K，滴加TUNEL反應混合液，滴加POD轉換劑，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.2.4 bax陽性結果判定 bax染色為細胞質或(和)細胞膜出現棕黃色顆粒，定位準確且無背景染色，分三步:(1)判定顏色，觀察所有片子的染色，無染色，也就是與背景染色無明顯差別為0分;淺染色為細胞質或(和)細胞膜染為淺棕黃色，與背景顏色有差別，為1分;染為棕黃色，介于1與3分之間，為2分;染為深棕黃色，與背景顏色差別顯著為3分。(2)看染色細胞比例，高倍鏡(400倍)下每個視野計數100個細胞，每張切片計數5個視野，計算陽性細胞數占總癌癥細胞的百分比。0%為0分，0% ～10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分。(3)兩者所得數值相加的分值結果為總分值，總分值＜4為陰性，≥4為陽性。

1.2.5 凋亡細胞的陽性結果判定及凋亡指數(AI)的計算凋亡細胞經TUNEL法處理后，細胞核被染為棕黃色，使用光學顯微鏡，計數每1 000個腫瘤細胞中凋亡細胞個數。需排除有嚴重的炎癥反應和壞死灶的區域，以免造成假陽性。AI為計數每1 000個腫瘤細胞中凋亡細胞所占的比例。

1.3 統計學分析 應用SPSS17.0軟件包處理。采用配對四格表的χ2檢驗及直線相關性分析。

2 結果

2.1 NSCLC組織中bax的表達及與臨床病理特征的關系 肺癌組織60例中bax陽性31例(48.3%)，癌旁正常組織20例中bax陽性12例(60%)，兩者差異無統計學意義(χ2=0.419，P=0.517)，但癌組織的染色均要深于正常組織。結果顯示，高分化組織的陽性表達率高于中低分化，有淋巴結轉移者陽性率較無淋巴結轉移者低，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期陽性率高于Ⅲ、Ⅳ期陽性率(均P＜0.05)。Bax的表達與年齡、性別、病理分型、是否合并胸腔積液、腫瘤直徑、是否吸煙、腫瘤生長在左肺還是右肺無明顯關系(P＞0.05)。見表1。

表1 NSCLC中bax的表達及于臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.2 bax與細胞凋亡之間的關系 bax分值0、1～2、3～4、5～6分的各組 AI分別為 3.57±0.55、5.44±1.41、8.05±1.40、10.05±1.62，相關性分析顯示bax積分與AI呈正相關(r=0.855，P=0.000)。

3 討論

近年來，凋亡異常在腫瘤的發生中所起的作用越來越受重視。凋亡過程的紊亂與腫瘤產生關系密切，它受多種基因的調控，包括凋亡促進基因、凋亡抑制基因，各種凋亡效應基因共同作用〔1～3〕。bax基因為凋亡促進基因。近年來，大量學者對bax、bcl-2聯合研究，并認為兩者的比值與腫瘤發展關系密切。bax存在于人體各個組織，研究表明它與肝癌、胃癌、骨肉瘤、血管瘤、腦損傷〔4～8〕的發生都有密切關系。

本實驗結果顯示bax在肺癌組織與癌旁正常組織中表達無明顯差異，與魏衛等〔9〕的結論一致。但辛彩霞等〔10，11〕研究結論認為bax在肺癌組織中的表達要高于癌旁正常組織，另有學者〔12，13〕認為bax在肺癌組織中的表達要低于癌旁正常組織、產生分歧的原因可能為:①實驗樣本量較小造成的誤差;②凋亡不足是腫瘤發生的原因，但腫瘤往往存在過度增殖，也可能存在大量凋亡，只是增殖的速度大于凋亡，這還需要大量的研究去證實。大量研究〔12，13〕認為bax蛋白在NSCLC中的表達低于正常肺組織，在高、中分化患者中的表達高于低分化者。本實驗結果與王鴻程等〔14〕的研究結果一致，提示bax表達下調可能與腫瘤的惡性程度有關，對其進行檢測有可能提示NSCLC患者的腫瘤惡性程度及判斷預后;者陽性率(33.3%)較無淋巴結轉移者(66.7%)低，本研究結果還提示bax表達下調在腫瘤的早期轉移有一定關系，bax表達下調的患者預后不好，與文獻〔15〕報道一致。bax表達與凋亡呈正相關，提示bax基因下調或缺失導致凋亡減少，與腫瘤的發生、發展密切相關。

bax基因的表達與NSCLC的臨床分期、分化程度及淋巴結轉移密切相關，但bax基因能否成為診斷NSCLC的腫瘤標記物及判斷其預后的有效指標，還有待于更多的研究去證實。

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