Smad4、MMP－2在食管鱗癌中的表達及其與侵襲轉移的關系

韓聚強 楊江霞 傅 天 李杰茹 李志麗 (河北醫科大學西山校區生理教研室，河北 石家莊 050200)

食管癌主要死亡原因是術后轉移。大量研究表明，食管癌的形成和轉移是一個多基因、多因子共同作用的結果。本研究通過對食管癌組織中Smad4和MMP-2蛋白表達的檢測，探討Smad4和MMP-2表達與食管癌侵襲轉移的關系及Smad4和MMP-2蛋白表達之間的相關性，為預測食管癌浸潤轉移提供客觀參考指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自河北醫科大學第四醫院2007年7月至2009年12月食管癌患者手術切除標本80例，其中男51例，女29例;年齡43～75歲，中位數年齡60歲;其中高分化鱗癌34例，中分化鱗癌22例，低分化鱗癌24例;有周圍淋巴結轉移者48例，無轉移者32例。同時留取癌旁1～2 cm處不典型增生組織27例，取切緣正常黏膜組織12例作對照。患者術前均未進行任何抗癌治療，所有患者均有完整臨床病理資料，所有標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續切片備用。

1.2 免疫組織化學方法 采用SP方法，DAB染色，SP免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術有限公司，鼠抗人MMP-2單克隆抗體購于北京中山生物技術有限公司，兔抗人Smad4多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。用已知陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化結果判斷 MMP-2和Smad4在細胞質和細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞，400×光學顯微鏡下每張切片至少計數10個視野，每個視野100個細胞，按陽性細胞所占百分比分為陽性或陰性，(-)無陽性細胞或陽性細胞＜5%，(+)陽性細胞＞5%。采用HPIAS-1000病理圖文分析系統，將陽性切片上的陽性染色信號轉化為灰度進行分析。選擇每張免疫組化切片，用組織切片空白處入射光的值作為定標。每張切片測定6個高倍視野(10×40)中的每個陽性細胞的胞質或膜的灰度，取平均值作為測定值，最后以凈灰度值為一張切片的終值，同時作為統計值。凈灰度值=間質空白處灰度值-癌巢(或上皮)陽性細胞的灰度值。

2 結果

2.1 食管癌中MMP-2和Smad4蛋白表達 MMP-2在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織和切緣正常組織，Smad4在癌組織中的表達明顯低于癌旁組織和切緣正常組織(均P＜0.01)，見表1。

2.2 MMP-2和Smad4蛋白表達與食管癌臨床病理參數的關系 MMP-2和Smad4的表達量與食管癌患者的性別、年齡及癌組織分化程度均無關(P＞0.05)，而與癌組織浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期等密切相關(P＜0.05)。見表2。

2.3 MMP-2與Smad4的相關分析 在食管癌組織中MMP-2的表達與Smad4的表達呈負相關(P＜0.05)。

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各種病變中的表達(±s)

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各種病變中的表達(±s)

與其他兩組比較:1)P＜0.01

灰度值正常組織 12 01) 73.145±11.6631)組別 n MMP-2灰度值 Smad4癌旁不典型增生 27 41.574±9.2211) 56.784±14.5801)癌組織 80 64.151±10.6721) 33.360±10.6141)

表2 MMP-2和Smad4在食管癌中的表達

3 討論

在腫瘤的發生和進展過程中，由于某些基因的異常表達及一系列的基因突變，使得一些腫瘤獲得浸潤及轉移的特性，脫離原發瘤，穿透基底膜進入結締組織，并侵襲淋巴管和血管等組織而發生轉移。顯然腫瘤轉移需要通過細胞與細胞間質或與其他細胞的一系列相互作用而完成。

MMP-2是降解細胞外基質(ECM)和基底膜主要結構的關鍵酶，與多種惡性腫瘤的發展、侵襲、轉移密切相關〔1，2〕。Li等〔3〕用免疫組化檢測了MMP-2蛋白在58例食管癌中的表達，發現MMP-2蛋白的陽性表達與食管癌浸潤深度、淋巴結轉及淋巴結轉移階段呈正相關。本研究結果與Qi等〔4〕的研究結果相同，提示MMP-2參與食管癌的發生，作為食管癌發生的早期事件。本研究還發現，腫瘤細胞向深層侵襲和以后的轉移與其分泌的MMP-2有關，MMP-2是食管癌侵襲和轉移的一種促進因素。

Smad4基因是一種抑癌基因，其蛋白產物Smad4蛋白為傳導TGF-β信號通路中一個關鍵的細胞內信使，將TGF-β信號從細胞膜傳至細胞核。Smad4基因突變和缺失導致Smad4蛋白的異常表達，與胰腺癌〔5〕、直腸癌〔6〕胃癌〔7〕、肝癌〔8〕等惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關，與Smad4表達陰性者比較，Smad4表達陽性者腫瘤分化較好，生長速度較慢，侵襲和轉移能力弱，預后較好。本研究與車啟芬〔9〕、李昊等〔10〕的研究結果相同，提示Smad4蛋白表達缺失可能導致TGF-β信號途徑的生長抑制效應的減弱或喪失并產生抗凋亡作用，從而具有選擇性生長優勢，導致食管癌發生。Smad4蛋白在臨床分期ⅡB+Ⅲ期和有淋巴結轉移的食管癌組織中的表達陽性明顯低于臨床分期Ⅰ+ⅡA期和無淋巴結轉移的食管癌組織。食管癌組織中Smad4的表達缺失與腫瘤的浸潤深度密切相關與Fukuchi等〔11〕報道一致。以上的結果說明，Smad4蛋白的表達缺失在食管癌的發展和侵襲轉移中具有重要作用。

在惡性腫瘤發生機制的癌基因研究中，許多學者提出了基因協同作用假說，認為在惡性腫瘤發生發展和轉移的各階段，至少有兩個或兩個以上功能不同的異常激活的基因各自發揮不同的作用，并在時間和空間上相互配合，協同細胞的癌變。本研究發現，MMP-2在食管癌組織中表達量明顯高于癌旁不典型增生組織，同時Smad4蛋白在食管癌組織中表達量也明顯低于癌旁不典型增生組織;Smad4蛋白表達量與MMP-2表達量在食管癌的浸潤、淋巴結轉移等方面呈顯著負相關，表明Smad4蛋白與MMP-2在食管癌的系列病理過程(如癌的發生、侵襲及淋巴結轉移)中，具有負調節的協同作用的可能。這可能是Smads基因突變或功能失活，導致TGF-β信號途徑傳導中斷，產生的過多TGF-β作用于腫瘤細胞誘導表達血管內皮生長因子、MMP-2和MMP-9，負調控金屬蛋白酶抑制因子，從而為蛋白酶提供豐富的微環境，有利于腫瘤細胞的遷移和浸潤適當的血管上皮細胞，直接或間接地縱容了腫瘤細胞的轉移。

1 Xiao CH，Feng YM，Li XQ，et al.Clinical significance and relationship of expression of matrix metalloproteinase-2 mRNA with breast cancer metastasis〔J〕.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005;43(9):599-604.

2 Li BH，Zhao P，Liu SZ，et al.Matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metallo-proteinase-2 in colorectal carcinoma invasion and metastasis〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(20):3046-50.

3 Li Y，Ma J，Guo Q，et al.Overexpression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Dis Esophagus，2009;22(8):664-7.

4 Qi M，Li JS，Li Y，et al.Clinicopathological significance of expressions of RECK and MMP-2 in esophageal squamous carcinoma〔J〕.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2010;32(4):283-5.

5 Zhao S，Venkatasubbarao K，Lazor JW，et al.Inhibition of STAT3 Tyr705 phosphorylation by Smad4 suppresses transforming growth factor beta-mediated invasion and metastasis in pancreatic cancer cells〔J〕.Cancer Res，2008;68(11):4221-8.

6 Wang H，Rajan S，Liu G，et al.Transforming growth factor beta suppresses beta-catenin/Wnt signaling and stimulates an adhesion response in human colon carcinoma cells in a Smad4/DPC4 independent manner〔J〕.Cancer Lett，2008;264(2):281-7.

7 Barros R，Pereira B，Duluc I，et al.Key elements of the BMP/SMADpathway co-localize with CDX2 in intestinal metaplasia and regulate CDX2 expression in human gastric cell lines〔J〕.J Pathol，2008;5(4):411-20.

8 Huang S，Zhang F，Miao L，et al.Lentiviral-mediated Smad4 RNAi induced anti-proliferation by p16 up-regulation and apoptosis by caspase 3 down-regulation in hepatoma SMMC-7721 cells［J］.Oncol Rep，2008;20(5):1053-9.

9 車啟芬，宋 陽，葉冬梅，等.Smad4在人食管癌中的表達〔J〕.解剖科學進展，2009;15(1):74-76.

10 李 昊，詹鶴琴，張洪福，等.SELIL和Smad4D蛋白表達與食管癌生物學行為的相關性研究〔J〕.臨床消化病雜志，2007;19(3):157-62.

11 Fukuchi M，Nakajima M，Miyazaki T，et al.Lack of activated Smad2 in transforming growth factor-beta signaling is an unfavorable prognostic factor in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Surg Oncol，2006;94(1):51-6.