CD151基因轉移對大鼠缺血后肢Rac1和Cdc42信號通路的影響

劉偉峰 于曉暉 劉正湘 左后娟 (淄博市中心醫院心內科，山東 淄博 55036)

四跨膜超家族蛋白(TM4SF)是細胞膜上蛋白質分子進化過程中序列高度保守的一類蛋白族群，亦是整合素的關聯蛋白〔1〕，其中CD151是TM4SF最重要的成員之一。我們過去的研究均證實CD151能促進血管新生〔2～4〕，但目前其作用的分子機制仍不清楚，Rac1和Cdc42信號分子與血管新生過程關系密切，在本研究中，我們通過重組腺相關病毒載體(rAAV)將CD151基因轉染至大鼠后肢肌肉組織中，然后建立后肢缺血模型，通過觀察CD151基因表達情況以及對Rac1和Cdc42信號通路的影響來進一步揭示CD151促血管新生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 pZeoSV-CD151由美國Tennessee大學惠贈。p-AAV-GFP由美國北卡羅萊那州立大學基因治療中心饋贈。大腸桿菌E.coliDH5α菌株(Invitrogen公司)。質粒p-AAV-CD151由本課題組前期構建。羊抗人CD151抗體(Santa Cruz公司)、PVDF膜(Life Science公司)。化學發光試劑ECL(Pirce公司)。β-actin抗體(Santa Cruz公司)，Rac1、Cdc42和 phospho-Rac1/cdc42(Cell Signaling Technology公司)。按照三質粒共轉染方法在人胚腎上皮細胞系(293細胞)包裝和復制生成rAAV-CD151和rAAV-GFP病毒，并用實時PCR法測定病毒滴度。

1.2 大鼠后肢局部轉染重組腺相關病毒 成年Wistar雄性大鼠，體質量200～250 g，隨機分為假手術組、缺血對照(生理鹽水)組、GFP組和CD151組，分別經肌肉多點注射生理鹽水，rAAV-GFP和rAAV-CD151(1.5×l011pfu/只)，假手術組和缺血對照組僅注射相同體積的生理鹽水。注射位點分別為:股內收肌(3點)、股四頭肌(3點)、半膜肌(2點)，腓腸肌(2點)，每個注射位點100 μl。基因轉染1 w后制備大鼠后肢缺血模型。

1.3 大鼠后肢缺血模型的建立 2%戊巴比妥鈉(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。行大鼠左后肢縱行切口從腹股溝韌帶向下延伸至膝關節。在股動脈起始部和遠端隱動脈與腿彎動脈分叉之間游離股動脈，結扎所有游離段股動脈分支，切除股動脈，建立大鼠后肢缺血模型，假手術組施行相同的手術步驟，但不切除股動脈。

1.4 Western印跡檢測局部肌肉組織CD151、Rac1和Cdc42的表達 術后5 w檢測四組樣品的CD151蛋白表達情況，以βactin為內參照。分別提取四組大鼠缺血后肢肌肉組織蛋白。取含等量蛋白質的裂解液加等體積2×加樣緩沖液(不含2-巰基乙醇)行SDS-PAGE電泳，電泳結束后25 V、4℃條件下過夜將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上，37℃ 1%脫脂奶粉封閉2.5 h后分別與相應抗體4℃孵育過夜，1∶5 000辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。最后經ECL顯色檢測結果。

2 結果

2.1 CD151蛋白質表達的檢測 各組動物肌肉組織均出現特異性條帶，假手術組、缺血對照組、GFP組條帶較窄且顏色較淺，CD151組呈現寬且顏色深的條帶(圖1)，結果顯示CD151蛋白質表達明顯增加〔(410.7±18.6)%〕，與缺血對照組、GFP組比較差異有統計學意義〔(201.3±16.7)%vs(209.6±19.4)%，P＜0.05〕，缺血對照組、GFP組比較表達差異無統計學意義(P＞0.05)，假手術組CD151蛋白質表達最少(100%)。說明CD151基因的導入明顯增加CD151蛋白質的表達。

2.2 CD151基因轉染對Rac1和Cdc42信號通路的影響Western印跡免疫印跡檢測p-Rac1/Cdc42、Rac1/2/3和Cdc42，p-Rac1/Cdc42分別用Rac1/2/3和Cdc42進行標準化處理，p-Ccdc42表達量 CD151組(503.6±20.1)%、缺血對照組(137.3±13.4)%、GFP組(144.6±12.7)%、假手術組為100%;p-Rac1表達量為CD151組(547.6±23.4)%、缺血對照組(140.6±12.4%)、GFP組為(147.2±13.2)%、假手術組為100%;結果顯示CD151組p-Rac1/Cdc42蛋白表達明顯高于其余三組(P＜0.01)，表明CD151蛋白表達的增加激活Rac1和Cdc42信號通路(圖2)。

圖1 Western印跡檢測大鼠缺血后肢CD151蛋白表達

圖2 Western印跡檢測大鼠缺血后肢p-Rac1/Cdc42、總Rac和總Cdc42的蛋白表達

3 討論

血管新生是體內重要的病理生理過程，在腫瘤的轉移浸潤以及缺血性疾病的血運重建等病理生理過程中發揮著十分重要的作用，它是指內皮細胞通過增殖和分化在原有血管基礎上以芽生或非芽生的形式生成血管〔5〕。

CD151能夠促進臍靜脈內皮細胞增殖、遷移及網管狀結構的形成〔2〕，且能夠促進缺血組織的血管形成并在一定程度上改善這些缺血組織器官的功能〔3，4〕。但CD151促血管新生的分子機制仍不明確，在進一步的研究中我們發現CD151蛋白表達可以激活缺血組織的MAPKs和PI3K/Akt信號通路，上述信號分子被認為參與了血管新生過程〔3，4〕，但是除此之外CD151是否還激活了其他的與血管新生有關的信號通路，Rac1和Cdc42信號分子與血管新生過程關系密切，內皮細胞在Matrigel模型中形成毛細血管管腔結構的過程中Rac1和Cdc42發揮了重要作用〔6〕，研究發現CD151基因缺失小鼠肺內皮細胞的趨化遷移，伸展和侵襲能力減弱，同時該細胞的Rac1和Cdc42活性明顯減弱〔7〕，表明Rac1和Cdc42參與了小鼠肺內皮細胞的趨化遷移和伸展等過程。

本研究顯示將CD151基因轉染至大鼠后肢肌肉組織內，6 w后CD151蛋白質表達明顯增加，表明外源性CD151基因能夠在大鼠缺血肌肉組織中有效表達，同時表明CD151可以激活Rac1和Cdc42信號通路，進而促進缺血下肢的血管新生，改善缺血肢體的功能。本實驗進一步豐富了CD151促血管新生的分子機制。

1 Hemler M.Tetraspanin functions and associated microdomains〔J〕.NatRev Mol Cell Biol，2005;6(10):801-11.

2 Zheng Z，Liu Z.CD151 gene delivery increases eNOS activity and induces ECV304 migration，proliferation and tube formation〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(1):66-72.

3 Zuo H，Liu Z，Liu X，et al.CD151 gene delivery after myocardial infarction promotes functional neovascularization and activates FAK signaling〔J〕.Mol Med，2009;15(9-10):307-15.

4 Zheng Z＇Liu Z.CD151 gene delivery activates PI3K/Akt pathway and promotes neovascularization after myocardial infarction in rats〔J〕.Mol Med，2006;12(9-10):214-20.

5 Dvorak H.Angiogenesis:update 2005〔J〕.J Thromb Haemost，2005;3(8):1835-42.

6 Bayless K，Davis G.The Cdc42 and Rac1 GTPases are required for capillary lumen formation in three-dimensional extracellular matrices〔J〕.J Cell Sci，2002;115(6):1123-36.

7 Takeda Y，Kazarov A，Butterfield C，et al.Deletion of tetraspanin Cd151 results in decreased pathologic angiogenesis in vivo and in vitro〔J〕.Blood，2007;109(4):1524-32.