BDNF對哮喘小鼠C7～T5節段脊髓后角p－CREB、CREB表達的上調作用

張寶輝 方秀斌 劉曉湘 (中國醫科大學神經生物學教研室，遼寧 沈陽 110001)

現代的觀點認為，支氣管哮喘是一種慢性炎癥疾病，而隨著分子生物學、遺傳學、免疫學、細胞生物學和病理學等技術的深入發展，證實了呼吸道廣泛存在神經肽網，神經異常機制也越來越受到重視，認為炎癥可影響神經和神經肽調控機制，而神經機制又反過來影響炎癥機制。由于支氣管哮喘的發病機制極其復雜，其病理機制至今尚未完全闡明。腦源性神經營養因子(BDNF)是繼神經生長因子(NGF)后發現的第2個神經營養因子，研究發現，在人的氣道平滑肌內，BDNF能上調Ca2+含量，認為BDNF很可能通過調節Ca2+含量來調節氣道平滑肌收縮，參與哮喘等氣道疾病〔1〕。另有研究證實，BDNF水平在過敏性哮喘未治療組比健康對照組、吸入糖皮質激素治療組明顯升高，有效的治療可降低血液循環中的BDNF水平，表明BDNF參與過敏性哮喘〔2〕。但BDNF能否通過調節p-CREB、CREB分子的表達參與哮喘仍未見文獻報道。本實驗旨在檢測BDNF被阻斷后，小鼠C7～T5節段脊髓后角內p-CREB、CREB的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備 雌性BALB/c小鼠30只，由首都醫科大學實驗動物中心提供。按隨機數字表法分組，每組10只。(1)哮喘組第1天每只小鼠腹腔注射20 μg OVA(Sigma公司)和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中;第8、15天每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中;第16天開始將小鼠置于封閉容器中，給予4%OVA(PBS配成)霧化吸入激發哮喘發作，每天1次，每次25 min，連續7 d。(2)ANTI-BDNF組，第19天開始霧化吸入前3 h鼻腔給BDNF抗體，其余均與哮喘組相同。(3)正常對照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后一次激發后24 h處死。

1.2 AniRes2005肺功能儀測氣道反應性 用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(80 mg/kg)，疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內操作臺上，氣管插管，呼吸比 15∶10，呼吸頻率90次/min，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿(mAch)用磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg，經頸外靜脈各注射 0.1 ml，記錄波形和數據。

1.3 免疫熒光 動物用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg體重)，用4%多聚甲醛灌流固定，將組織塊固定24 h，移入30%蔗糖緩沖液中至標本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機連續切片(片厚8 μm)。冷風干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干;滴加一抗 p-CREB、CREB(購自 Santa Cruz公司)工作濃度為1∶150，4℃孵育過夜;PBS充分洗滌，滴加工作濃度為1∶100 FITC標記的二抗(購自Sant Crutz公司)，孵育40 min;PBS充分洗滌，甘油封片。用OlympusBX51型熒光顯微鏡進行觀察，綠色熒光為陽性表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件對數據進行統計分析，結果用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 哮喘模型制作結果 正常對照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應;哮喘組動物在霧化吸入卵蛋白3次后，大部分哮喘發作，表現為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳;ANTI-BDNF組動物，前3次霧化吸入卵蛋白后，大部分哮喘發作，應用BDNF抗體阻斷后，誘喘反應不明顯。

2.2 AniRes2005肺功能儀測氣道阻力 哮喘組小鼠對mAch的濃度反應曲線明顯上移，其呼氣阻力和吸氣阻力顯著高于正常對照組(P＜0.01)，證明哮喘小鼠對mAch的氣道反應性顯著高于正常小鼠，證明哮喘模型建立成功;anti-BDNF組對mAch的濃度反應曲線明顯低于哮喘組(P＜0.01)，提示在經鼻腔滴加BDNF抗體后，哮喘小鼠的氣道高反應降低(圖1)。

2.3 免疫熒光結果 CREB的檢測結果:從圖2上可以看出，哮喘組小鼠的C7～T5節段脊髓后角的CREB蛋白表達量顯著高于于正常對照組小鼠的表達，顯微圖像分析表明，哮喘組CREB陽性反應產物MOD值明顯高于對照組(P＜0.01);相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經鼻滴加BDNF抗體后，C7～T5節段脊髓后角的CREB表達量明顯低于哮喘組的表達量，顯微圖像分析表明，anti-BDNF組CREB陽性反應產物MOD值明顯低于哮喘組(P＜0.01)。

p-CREB的檢測結果:從圖3可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節段脊髓后角的p-CREB蛋白表達量顯著高于于正常對照組小鼠的表達;顯微圖像分析表明，哮喘組p-CREB陽性反應產物MOD值明顯高于對照組(P＜0.01);相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經鼻滴加BDNF抗體后，C7～T5節段脊髓后角p-CREB的表達量明顯低于哮喘組的表達量;顯微圖像分析表明，anti-BDNF組p-CREB陽性反應產物MOD值明顯低于哮喘組(P＜0.01)。見表1。

圖1 Ani Res2005肺功能儀檢測氣道阻力

圖2 免疫熒光方法檢測各組小鼠CREB的表達(×200)

圖3 免疫熒光方法檢測各組小鼠p-CREB的表達(×200)

表1 各上鼠CREB、p-CREB的光密度值(±s)

表1 各上鼠CREB、p-CREB的光密度值(±s)

與哮喘組比較:1)P＜0.01

CREB p-CREB正常對照組 17.43±2.361) 16.41±1.961)組別哮喘組 35.46±3.25 32.38±3.19 anti-BDNF組 29.16±3.081) 26.15±2.681)

3 討論

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的反復發作的可逆性氣流受限和氣道高反應性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，我國哮喘發病率為1%，其中兒童達3%。近年來支氣管哮喘與細胞信號傳導的研究一直受到國內外學者的普遍關注。越來越多的研究發現哮喘發生不僅僅與免疫炎癥相關，同時神經系統也參與了哮喘的發病。但對于他們之間的相互作用及其機制尚不完全清楚。

BDNF是繼NGF后發現的第2個神經營養因子，二者同屬于NGF家族。研究發現，在過敏性疾病中，氣道上皮細胞高表達NGF和BDNF，而這些神經營養因子的表達可以延長組織嗜酸性粒細胞的存活，從而加重哮喘等過敏性疾病的發病過程。而在過敏性哮喘患者血漿、血清、血小板中BDNF水平比對照組明顯升高，并與氣道阻塞、氣道高反應性有關，糖皮質激素可通過活化的免疫細胞抑制BDNF產生〔3〕。同時有研究發現，BDNF可影響慢性氣道阻塞和局部神經元高反應性，在應用沙美特羅(β2促效劑，擴張支氣管)治療哮喘時，血清和血小板的BDNF濃度被顯著上調〔4〕。綜上可知，BDNF在哮喘發病機制中發揮重要作用。但是BDNF是通過哪些信號通路參與哮喘發病，在哮喘發病機制中具體發揮何種作用尚需進一步研究。

cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是在研究生長抑素(somaostatin)基因的表達與調節時發現的，生長抑素基因的表達受cAMP信號的調控，對該基因5'端上游區域的研究發現，8個堿基對的回文序列5'-TGACGTCA-3'，決定cAMP誘導的轉錄反應發生，這一元件被稱為cAMP反應元件(cAMP-response element，CRE)。繼而在尋找識別CRE模體的蛋白因子的過程中發現了43kD的CREB，CREB作為細胞內的第三信使，定位于細胞核內。在神經系統中，很多細胞外刺激物能夠激活CREB及其家族成員，有賴于CREB轉錄的基因表達參予了從疾病發生到轉變的復雜而多樣的過程。在生長因子和其他刺激物調控的廣泛的系列過程如:神經元細胞的增殖、生長、存活，神經元生長過程中的突出連接等中起著重要作用，而且在大腦學習與記憶、神經元保護、某些疾病的發病中也起著非常重要的作用〔5～7〕。但BDNF能否通過調節p-CREB、CREB分子的表達參與哮喘仍未見文獻報道。

從免疫熒光結果可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節段脊髓后角的CREB、p-CREB蛋白表達量顯著高于于正常對照組，相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經鼻滴加BDNF抗體后，C7-T5節段脊髓后角的CREB、p-CREB的表達量明顯降低，而在應用AniRes2005肺功能儀對各組小鼠進行氣道阻力測定時也發現，anti-BDNF組對mAch的濃度反應曲線明顯低于哮喘組，提示在經鼻腔滴加BDNF抗體后，哮喘小鼠的氣道高反應降低，這結果提示BDNF很可能是通過上調CREB的表達來參與哮喘發病機制。

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3 Lommatzsch M，ScMoetcke K，Klotz J，et al.Brain-deriveded neurotrophic factor in platelets and airflow limitation in asthma〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005;171(2):115-20.

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