大鼠羊膜上皮細胞的生物學特性

段現花 王德廣 歐陽長杰 曲德偉 (徐州醫學院解剖學教研室，江蘇 徐州 221002)

羊膜上皮細胞(AECs)起源于胚胎發育時期的胚泡內細胞團〔1，2〕，是將來發育形成胎兒的部分。人受精8 d內細胞團分化成上胚層和下胚層，AECs源于上胚層〔3〕，也有研究表明胚胎干細胞源于內細胞團〔4〕。研究證實，大鼠AECs有趨向上胚層、中胚層和下胚層細胞分化的潛能〔5，6〕，因此大鼠 AECs作為再生醫學細胞資源參與疾病治療已受到廣泛關注〔7〕。本研究通過免疫組化和流式細胞儀技術對分離、培養的羊膜干細胞進行鑒定，為細胞移植治療脊髓損傷提供優良的種子細胞〔8〕。

1 材料與方法

1.1 材料 無特殊病原體(SPF)孕14～16 d的SD大鼠，由徐州醫學院動物中心提供。無菌采集羊膜標本。實驗中對動物的操作嚴格參照中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物指導性意見》中有關規定執行。DMEM/F-12(Gbibo公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，0.25%胰蛋白酶、小鼠nestin抗體、小鼠 β-Ⅲ-tublin抗體、小鼠膠原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、山羊抗小鼠IgG和青霉素-鏈霉素溶液(PS)(碧云天公司)，CD29和CD44抗體(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 AECs的分離與培養 采用機械法剝離胎盤羊膜組織，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗，除盡表面血跡，于含有適量基礎培養基的培養皿中剪碎羊膜至1 mm3左右，轉移組織懸液于50 ml離心管中，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃均勻消化15 min，用含有10%血清的完全培養基終止消化，400目不銹鋼濾網過濾，收集單細胞懸液于離心管中，1 200 r/min離心5 min，加入含有10%FBS的完全培養基重懸細胞，用臺盤藍計數細胞密度，以1×106的細胞密度接種于25 ml的培養瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。1次/3 d換液，1 w后待細胞長滿瓶底的90%時進行傳代，取第2～3代的細胞進行免疫細胞化學和流式細胞分析。

1.3 大鼠AECs的鑒定

1.3.1 免疫熒光細胞化學 多聚賴氨酸包被爬片的12孔板，取2～3代的rAECs用0.25%胰酶消化、傳代，然后接種，細胞達到70%融合時，吸除培養基，用37℃預熱PBS漂洗3次，預冷4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，5 min/次，用0.3%Triton-X100室溫下孵育15 min，PBS漂洗3次，用含有10%FBS的PBS室溫下封閉40 min。吸出后直接加入nestin、β-Ⅲ-tublin或 GFAP抗體，37℃孵育30 min后移入4℃冰箱過夜，次日用PBS漂洗3次，避光條件下加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，然后用hochest33258孵育15 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞表面抗原 用0.25%胰酶消化收集2～3代rAECs于50 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，吸除上清，用適量的PBS漂洗細胞，調整細胞密度為1×106/ml分裝于3個10 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，吸除上清，每管加入100 μl PBS重懸細胞，避光條件下加入熒光標記單抗CD29-FITC和 CD44-PE 各 20 μl，對照組加入等量 PBS，混勻，37℃避光孵育30 min后1 200 r/min離心5 min，吸除上清后用PBS漂洗細胞2次并離心，每管加入200～400 μl PBS，混勻，移入流式管中，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達情況。

2 結果

2.1 大鼠AECs的生長及增殖特點 原代培養1 d后，有少量細胞貼壁;第3天以后，貼壁細胞逐漸增多，形態多為扁平不規則的多角形或梭形，胞體大，胞核呈分裂相。培養1 w后，細胞貼壁牢靠，生長較為旺盛，細胞呈鋪路石樣緊密排列，匯合度達90%以上時，進行傳代培養。傳代后的細胞較原代易于貼壁，增殖速度加快。六代以后的細胞增殖逐漸減慢，胞體變大呈扁平樣。見圖1。

圖1 培養3 d原代AECs

2.2 大鼠羊膜上皮細胞的免疫細胞化學特征 免疫熒光檢測結果顯示，培養的細胞不同程度的表達nestin，但不表達β-Ⅲ-tublin和GFAP。見圖2。

圖2 大鼠羊膜上皮細胞的免疫熒光染色

2.3 細胞表面抗原檢測結果 流式細胞儀檢測結果顯示，AECs高表達骨髓間充質干細胞表面標記蛋白 CD29達到94.31%，CD44高達99.98%。

3 討論

目前的研究證實，大鼠AECs表達胚胎干細胞的部分多能性表面抗原以及細胞內分子標志。在體外經過特定條件誘導下能向三個胚層細胞類型分化〔4，9〕，其中向神經外胚層細胞方向分化的研究比較多〔10〕。此外，由于AECs組織來源豐富，較少引起醫學倫理學爭議，已成為了一種有潛力的再生醫學干細胞來源。

巢蛋白nestin是普遍用來鑒定神經干細胞及神經前體細胞的蛋白〔5，11〕，但也有相關報道巢蛋白在大鼠間充質干細胞和人肝干細胞中表達〔12〕。β-Ⅲ-tublin是在神經元分化過程中檢測到的蛋白，表達于未成熟神經元中〔5〕。GFAP是在成熟星形膠質細胞中特異表達的蛋白〔8〕。免疫細胞化學檢測結果表明AECs表達nestin，具備干細胞特性。β-Ⅲ-tublin和GFAP的陰性表達說明羊膜干細胞在培養過程中沒有向神經元或星形膠質細胞分化。但是提取大鼠定向誘導的AECs總RNA〔13〕，其中有β-Ⅲ-tublin以及GFAP的基因表達，這說明AECs可定向誘導分化為神經元的潛能。研究表明AECs表達間充質干細胞表面抗原CD29和CD44〔9〕，但是不表達造血干細胞標記物CD34，本實驗結果與之一致。

依此看來，AECs可以作為干細胞資源參與再生醫學的研究，并有望參與神經系統疾病臨床治療。之前已有關于AECs治療脊髓損傷的研究報道〔14〕，但其治療效果并不理想。目前基因修飾的細胞移植治療脊髓損傷越來越受到學者們的關注。olig-2是一種bHLH轉錄因子，對于少突膠質細胞的發生及其形成中樞神經系統髓鞘發揮重要作用〔15〕。有研究報道轉染olig-2的神經干細胞能有效改善脊髓損傷后的髓鞘形成〔16〕。基于大鼠AECs的分離培養及鑒定已經成熟，而且具有優越的干細胞特性，因此接下來將進行olig-2基因修飾AECs的研究，為脊髓損傷的細胞移植治療奠定基礎。

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