幾種實驗小鼠骨髓染色體和中國倉鼠不同組織同工酶分析

周華山 陳 祥 趙 明 胡火珍

(四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064)

染色體是遺傳物質的載體，生物的染色體非常穩定，不同物種的染色體都有各自特定的形態結構(包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等)特征。染色體組型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態與功能之間的關系不可缺少的重要手段。其研究已成為動物遺傳、育種、病理、繁殖等學科中的一個非常重要的課題。染色體的制備最常用的途徑是從骨髓細胞中制備染色體，此法不需無菌操作，設備簡單，所用時間較短，適于大多數的動物體。鼠四肢骨內骨髓細胞中的造血干細胞是生成各種血細胞和原始細胞，具有高度的分裂能力。本實驗采用這一材料，通過前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，進行染色體組型分析。

同工酶是指同一種屬中不同基因位點或同一位點的復等位基因編碼的多肽鏈所組成的單體、純聚體或雜交體。同工酶存在同一個體或同一組織中，在生理上、免疫學上、理化性質上都存在差異。由于酶是基因編碼的產物，它在電場中遷移率的改變反映了酶蛋白的大小構形和肽鏈氨基酸的序列變化，即編碼DNA順序上的變化，所以可通過分析酶譜的變化來獲得我們所需要的遺傳信息。同工酶在臨床醫學應用上可能在細胞癌變過程中有多種同工酶譜發生變化。細胞同工酶分析可用來鑒定細胞種屬，此外，因同工酶譜有臟器特異性，故同工酶常可較特異地反映某一臟器的病變。同工酶有多種類型，通常以乳酸脫氫酶(LDH)、核苷磷酸化酶(NP)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、蘋果酸脫氫酶(MD)等幾種酶譜作為常用分析指標。由于同工酶的研究是從基因產物認識基因的存在，由生化表現型反映基因型，因此，同工酶已廣泛應用到生物的遺傳育種，動植物的分類及進化，臨床檢驗以及診斷某些疾病等研究領域中〔1〕。本文通過優化的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離供試細胞株和倉鼠四種不同臟器同工酶，對倉鼠及幾種小鼠染色體組型及倉鼠不同組織同工酶進行了分析，初步探討倉鼠與C57小鼠和ICR小鼠間的差異。同時揭示了同工酶在不同臟器組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料 中國倉鼠購于中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所;C57小鼠和ICR小鼠由四川省醫學科學院實驗動物研究中心提供;常用試劑均購于成都奧克生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠骨髓細胞染色體制備方法 本文染色體制備操作方法參照四川大學生命科學學院編寫的實驗指導〔2〕及部分文獻報道的實驗方案〔3～6〕。

1.2.1.1 收集骨髓有核細胞 實驗前4～5 h，將鼠稱重后按100 μg/10 g體重從腹部注入適量體積的秋水仙素溶液，斷頸處死，用剪刀剝取后腿股骨和脛骨，紗布去除表面肌肉，再用骨鉗剪去兩端，用注射器抽取PBS緩沖液沖洗骨髓腔，細胞收集于離心管中。反復沖洗幾次至骨腔變白為止;離心1 000 r/min 8 min，去上清。

1.2.1.2 低滲處理 向離心管中加入8 ml于39℃預熱的0.075 mol/L KCl低滲液，置于39℃水浴鍋中35 min;離心1 000 r/min 8 min。

1.2.1.3 固定 低滲結束前1 min，向離心管中加入1 ml固定液行預固定，然后經1 000 r/min離心8 min，吸去上清液，加入3∶1甲醇-冰醋酸固定液至8 ml刻度，用吸管輕輕吹散細胞沉淀塊，放入39℃水浴鍋中20 min。

1.2.1.4 滴片 固定結束后，離心1 000 r/min 8 min，去上清，在留有細胞沉淀的離心管內加入1 ml固定液將細胞吹打均勻，取冰水預冷的濕玻片滴片(距離玻片上方至少30 cm高處)，每片滴3～4滴后迅速吹散細胞，置酒精燈上微烤，放玻片架自然晾干。

1.2.1.5 染色 晾干后的玻片置1∶9 Giemsa染液染色10～15 min，取出后用蒸餾水或自來水沖片，自然晾干。

1.2.1.6 鏡檢 將破片置于顯微鏡下觀察染色體制備情況，找出分裂相比較好的視野拍照，并計數染色體數目。

1.2.2 中國倉鼠肝、腎、心、脾四種組織及CHO細胞同工酶分析

1.2.2.1 細胞及組織蛋白提取 取中國倉鼠肝、腎、心、脾四種臟器，保存于液氮中。提取總蛋白時從液氮中取出臟器，放入勻漿器內，加入少許細胞裂解液并充分勻漿。冷凍離心機中14 000 r/min離心15 min收集上清備用。生長于培養瓶中的CHO細胞收集于離心管中，用PBS緩沖液清洗幾遍后轉移入1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml細胞裂解液。然后用液氮反復凍融3～5次，使細胞完全破碎，完畢后于冷凍離心機中14 000 r/min離心15 min收集上清用于后續電泳分析。

1.2.2.2 電泳及顯色 凝膠制備:采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，由于不能讓蛋白變性，所以電泳系統中不允許變性劑的存在。PAGE配方與SDS-PAGE配方相同，但需將其中的變性劑SDS去掉〔7〕。采用8%和12%的凝膠就能達到較好的分離效果。電泳條件也與SDS-PAGE相同，具體操作步驟可查閱相關文獻〔8〕。顯色:電泳結束后，關閉電源，取出膠板用清水沖洗幾遍，放入染色盒內，然后倒入預先配制的顯色液淹沒整個膠片。之后將染色盒置于37度培養箱中顯色。各個酶的染色液配方見下表〔8，9〕。

1.2.2.3 固定照膠 當凝膠片上出現染色條帶后即可停止染色，小心取出膠片放入培養皿中，加入酶固定液作用一定時間，然后可在凝膠成像儀上拍照存檔。

表1 各個酶系統染色液配方

2 結果

2.1 經滴片染色后可于顯微鏡下觀察到染色體分型情況 本實驗所用中國倉鼠，經骨髓細胞染色體制備觀察到其染色體數為2n=28，中著絲粒染色體，近中著絲粒染色體和端著絲粒染色體均存在于細胞分裂相中(見圖1)。而C57小鼠和ICR小鼠的染色體為2n=40，均為端著絲粒染色體(見圖2和圖3)。

圖1 倉鼠骨髓細胞染色體制備(2n=28)

圖2 C57小鼠骨髓細胞染色體制備(2n=40)

圖3 ICR小鼠骨髓細胞染色體制備(2n=40)

圖4 細胞株及四種臟器組織同工酶顯色條帶

2.2 同工酶分析顯示不同組織三種酶表達情況 從CHO細胞和四種組織中提取的總蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，浸于對應的酶系統染色液中染色，即可在膠片上出現特異條帶。LDH表達量高，出現條帶的時間稍快，2 min便出現條帶。LDH在四種臟器組織中均有表達，且在腎、心和脾臟中有較高含量，并出現了四條帶，表現不同的同工酶亞型;G6PD和NP顯帶時間較長，需要30 min左右，在各個組織中也有不同程度的表達(圖4)。

3 討論

動物的染色體穩定，不同物種的染色體都有各自特定的形態結構(包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等)特征，而且這種形態特征是相對穩定的。染色體組型分析是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態與功能之間的關系不可缺少的重要手段。

在生物學中，同工酶可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發育、組織分化等。同工酶的特征為屬內種的分類和親緣演化關系可提供更多的證據。在醫學方面，同工酶是研究癌瘤發生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發生胚胎化現象，即合成過多的胎兒型同工酶。此外，因同工酶譜有臟器特異性，故同工酶?？奢^特異地反映某一臟器的病變。

本課題采用染色體及同工酶分析探討幾種常用實驗小鼠細胞遺傳特性及同工酶的組織特異性。

本實驗發現中國倉鼠、C57小鼠和ICR小鼠雖然都是小鼠，但是染色體組型不同，中國倉鼠是2n=28，后兩種小鼠則是2n=40，染色體組中染色體的形態也不一樣，中國倉鼠染色體呈“X”形，可見明顯的著絲粒，中著絲、近中著絲粒及近端著絲染色體均存在。而C57和ICR鼠均為端著絲粒染色體，呈“U”形，染色體較小，分散均勻。從該實驗結果可以看出，小鼠不同種屬染色體數目并不相同，因此表現出不同的表型。

同工酶分析發現，LDH含量較其他兩種酶高，染色時出現條帶的時間也稍短，2 min便出現。LDH在四種臟器組織中均有表達，且在腎、心和脾臟中含量較高，并出現了四條帶，表現不同的同工酶亞型;G6PD和NP顯帶時間較長，需要30 min左右，在各個組織中也有不同程度的表達。其中G6PD在腎臟中含量較高，且與細胞株內表達情況相似。NP在四種臟器組織中的表達情況與細胞株的也很相似，幾乎出現在同一大小范圍內。

在實驗過程中，我們作了多項改良，使實驗效果更好。我們制備染色體的方法是以教研室之前優化方案為基準，并在此基礎上做了適當改進。秋水仙素的量盡量控制在10 μg/g體重效果較好，也有文獻報道5 μg/g體重為宜〔10〕;低滲時間比一般處理時間有所延長，本實驗處理35 min能達到較好的制備效果;混勻細胞時注意吹打不能用力過猛，避免使細胞破碎，染色體提前釋放而影響實驗結果;滴片時保證一定的高度以便染色體能充分散開而不互相重疊;最后需要注意離心速度不宜太高以免使細胞提前破碎，太低則可能損失細胞。染色體制備過程雖然比較簡單，但每一步的操作都必須小心謹慎，需要注意的事項也很多，造成失敗的原因也很多〔11，12〕，所以需要牢記實驗步驟按部就班的操作。

同工酶分析亦可用于體外培養細胞間交叉污染的鑒定。同工酶分析實驗過程中，保證蛋白質的活性是關鍵。因此電泳系統中必須去除變性劑等可能使蛋白變性的因素以及提取蛋白過程中應盡量在低溫環境下進行。保持蛋白的活性是同工酶特異染色的基礎，否則電泳后的膠片將無法在染色液的作用下顯示相應的條帶。本實驗的酶系統染色液配方綜合了文獻報道的幾種染色方案，最終也證明仍然能夠達到較好的效果，此染色方案可以作為其他實驗室同工酶分析實驗者的參考。

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10 譚秀華，梁 磊.秋水仙素對小鼠骨髓細胞有絲分裂的影響〔J〕.中國現代藥物應用，2007;1(5):6-7.

11 劉涌濤，馬全詳，劉慧娟.小鼠骨髓細胞染色體標本制備中的失誤與對策.生物學通報，2003;38(6):53-4.

12 黃 燕，趙小平，余 紅，等.動物骨髓細胞染色體標本制備失敗的原因分析〔J〕.生物學通報，2006;41(1):52-3.