殼聚糖磷酯酰膽堿對AD大鼠海馬中誘導型一氧化氮合酶和IκB激酶β表達的影響

郭 鶴 孟慶慧 汪娟娟 劉 敏 (濰坊醫學院護理學院，山東 濰坊 261053)

阿爾茨海默病(AD)是常見的癡呆疾病，它是一種中樞神經系統退行性疾病，其病因和發病機制迄今仍不明確。所以尚缺乏有效針對性強的預防治療措施。近期研究表明，腦內慢性炎癥可能是AD的重要致病原因之一〔1〕，抗炎治療是目前研究AD的熱點問題之一。李秀艷等〔2〕研究指出殼聚糖磷脂膽堿復合物可提高AD大鼠腦內乙酰膽堿(ACh)含量，改善腦功能。本實驗研究殼聚糖磷酯膽堿對AD大鼠的抗炎作用。采用大鼠雙側海馬注射Aβ25～35制備AD炎性模型，觀察殼聚糖磷酯膽堿對AD大鼠腦海馬內炎性因子iNOS、IKKβ表達和AD大鼠的學習記憶能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠30只，清潔級，8月齡，體重(350±30)g(山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物部)。

1.2 主要藥品與試劑 殼聚糖(青島云宙生物科技有限公司，脫乙酰度97.5%);大豆卵磷脂(北京華清美恒天然產物技術開發有限公司，磷脂酰膽堿含量40%);Aβ25～35(美國 Sigma公司);iNOS和IKKβ抗體(美國Biowoild公司);PV法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.3 藥物制備 準確稱取室溫下真空干燥的磷脂及β-環糊精各適量，溶于200 ml 1%殼聚糖乙酸溶液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾，將過濾后的溶液經蠕動泵導入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴(直徑0.7 mm)，根據實驗設置控制氣流量及進風溫度，噴霧干燥“一步”制成粉末微球，得到殼聚糖磷脂酰膽堿超細粉末。分光光度法測定殼聚糖含量70.63%。

1.4 主要儀器 DMS-2 MORRIS水迷宮系統(中國醫學科學院藥物研究所);江灣-I型C腦立體定向儀(第二軍醫大學);DME型光學顯微鏡和超薄組織切片機(德國Leica公司)。

1.5 Aβ25～35的孵育 用無菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成10 μg/μl。37℃孵育 7 d，使其變為凝聚態。

1.6 實驗方法

1.6.1 動物分組及處理方法 30只Wistar大鼠隨機化分組:對照組、AD模型組和殼聚糖磷酯酰膽堿藥物組，各組10只。藥物組和模型組雙側海馬注射Aβ25～35;對照組經同樣步驟注射0.9%生理鹽水。藥物組350 mg/kg灌胃，另兩組0.9%生理鹽水2 ml灌胃，共干預28 d。

1.6.2 AD模型制備 10%水合氯醛將模型組和藥物組大鼠麻醉后，參照大鼠腦立體定位圖譜，將頭部固定于腦立體定位儀上，常規備皮消毒，切開，暴露前囟，牙科鉆打孔后，將Aβ25～35懸浮液用微量注射器注入左右側海馬區各5 μl(前囟后3.5 mm，左右旁開2.5 mm，進針深3.0 mm)，緩慢注5 min，留針10 min，使其充分彌散，緩慢退針。消毒傷口，縫合，定期手術部位消毒。

1.6.3 Morris水迷宮觀察 該實驗檢測大鼠學習記憶能力，每次6 d，共三次(造模前，造模7 d后，藥物干預28 d后)，實驗分兩部分，5 d定位航行試驗和1 d空間探索實驗。5 d定位航行試驗中，每天上午，下午各一次，分別將每只大鼠從四個象限面朝壁放入水中，記錄尋找平臺所用時間，既大鼠逃避潛伏期(EL)。如果大鼠2 min內未找到平臺，將其牽引平臺處停留10 s，EL計120 s。第六天空間探索實驗，撤去平臺，選第一象限入為水點將大鼠面朝壁放入，測其在2 min內跨過原平臺位置次數和在原平臺象限停留時間。

1.6.4 HE和免疫組織化學染色 10%水合氯醛將大鼠麻醉，0.9%生理鹽水200 ml，4%多聚甲醛300～400 ml心臟灌注，然后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，冠狀面切取腦海馬注射點周圍組織，經浸洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟后，每只大鼠隨機取相同部位連續5張切片，進行常規HE染色和免疫組織化學染色檢測。

2 結果

2.1 殼聚糖磷酯酰膽堿對大鼠學習記憶水平的影響 造模前，各組大鼠學習記憶水平比較沒有差異(P＞0.05)。造模7 d后，模型組和藥物組的學習記憶水平明顯低于對照組(P＜0.05)，藥物干預28 d后，模型組大鼠AEL明顯延長、空間探索實驗單位時間內跨越原平臺次數和在原平臺象限停留時間減少，與對照組有顯著差異(P＜0.05)，和藥物組也有顯著統計學差異(P＜0.05)，每組兩兩比較結果見表1，表2。

2.2 HE觀察結果 光鏡下HE染色結果顯示，對照組和藥物組大鼠海馬神經細胞排列規則整齊，細胞形態完整，但藥物組有較少的壞死神經細胞(圖1A，B)。模型組大鼠海馬注射區周圍可見海馬神經細胞結構排列紊亂，局部神經元受損，小膠質細胞增生明顯，胞核固縮，細胞染色變深(圖1C)。

表1 各組大鼠水迷宮逃避潛伏期成績(±s，n=10)

表1 各組大鼠水迷宮逃避潛伏期成績(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;與藥物組比較:2)P＜0.05

組別 造模前(s) 造模7 d后(s) 造模28 d后(s)對照組0.688 0.00 0.00 15.87±6.90 12.06±5.89 11.91±5.11模型組 15.38±8.14 25.33±13.631) 27.08±9.951)2)藥物組 15.53±7.79 25.76±16.33 17.54±8.07 F值 0.374 89.235 222.387 P值

表2 各組大鼠空間探索實驗成績(±s，n=10)

表2 各組大鼠空間探索實驗成績(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 跨越平臺次數造模前 造模7 d后 造模28 d后平臺象限停留時間(s)造模前 造模7 d后 造模28 d后對照組 6.05±1.54 7.25±2.79 8.05±2.161) 40.23±15.82 47.73±17.70 53.84±15.551)模型組 5.50±1.32 3.25±1.83 3.70±2.03 40.04±19.19 15.37±11.39 20.44±17.54藥物組 5.75±1.33 3.40±1.64 6.00±2.221) 37.70±16.98 16.61±8.47 37.67±18.461)F值 0.774 22.343 20.673 0.132 39.199 18.801 P值0.466 0.00 0.00 0.877 0.00 0.00

2.3 免疫組織化學結果 圖2可見，陽性細胞呈棕黃色，模型組海馬CA1區可見iNOS和IKKβ大量表達(iNOS胞核、胞質均有表達，IKKβ胞質表達)。對照組陽性細胞表達很少，藥物組陽性細胞表達介于二者之間，見表3。

圖1 不同組海馬C A1區HE染色的病理改變(HE，×400)

圖2 不同組海馬CA1區iNOS及IKKβ表達(DAB，×400)

表3 各組大鼠的iNOS和IKKβ陽性細胞表達數(±s，n=10)

表3 各組大鼠的iNOS和IKKβ陽性細胞表達數(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

iNOS對照組 8.80±1.791) 9.02±2.381)組別 iKKβ 0.00 0.00模型組 41.40±4.17 38.20±2.38藥物組 20.40±4.222) 19.80±4.602)F值 96.827 99.074 P值

3 討論

Aβ異常沉積形成老年斑是AD典型病理特征。近年實驗研究表明，炎癥反應貫穿AD慢性病程的始終，膠質細胞活化是AD腦炎癥反應的一個顯著特征，它能誘導一系列炎癥細胞活化，增殖〔3～5〕。激活的小膠質細胞存在很強的介導炎癥反應作用同時還能上調炎癥因子表達(如 TNF-α、IL-6、IL-1 等)〔6〕。本實驗采用大鼠雙側海馬立體定向注射Aβ25～35的方法建立A D動物模型，觀察殼聚糖磷脂膽堿對在體條件下Aβ25～35誘導的小膠質細胞的活化及其分泌產物的影響。

IκB激酶是 NF-κB信號轉導途徑成員之一，IKKβ是 IκB激活作用的主要成分〔7〕。經典途徑 IKKβ/NF-κB 激活 NF-κB，誘導炎癥反應的表達與細胞凋亡〔8〕。IKKβ過表達或活性增加可以有效刺激炎癥因子的生成，從而增加炎癥反應〔9，10〕。Aβ能激活膠質細胞內的 NF-κB通路，促使炎癥因子分泌iNOS〔11〕。iNOS是炎癥中的一種反應性酶類，是膠質細胞增生表達與神經元損傷的標志。Capiralla等〔12〕研究通過抑制NF-κB轉錄和若干NF-κB 靶基因的表達，可抑制IKK/IκB/NF-κB通路，減輕AD腦炎癥反應。因此，IKKβ和iNOS是炎癥反應中的重要因子。用藥物抑制IκB激酶激活作用，降低NF-κB的激活，可能起到抑制炎癥因子IKKβ，iNOS的激活增生，從而抑制IKKβ/NF-κB通路，減輕AD腦炎癥反應。本研究說明AD模型制備成功及藥物殼聚糖磷脂膽堿有抑制海馬部位炎癥反應的作用。可能的機制是殼聚糖磷酯酰膽堿有一定的抑制或延遲IκB激酶激活，起到保護神經膠質細胞作用，降低了炎癥因子激活增生，從而抑制或延遲了IKKβ/NF-κB通路的激活。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰化產物，具有良好的生物相容性，能打開細胞連接，可調節細胞的增殖、分化和細胞因子的產生，清除自由基，中和毒素，保護腦神經元和神經膠質細胞膜的作用，在活化神經細胞和抗衰老方面具有特殊功效，其抗炎作用可延遲并減輕AD的病理改變。機體服用磷脂后經轉化，可增加ACh含量，直接被大腦利用。本實驗將殼聚糖和磷脂采用噴霧干燥方法制備殼聚糖磷脂微球，提高其黏附性和降低清除率，可控制藥物的釋放，增加了藥物生物利用度和親水性藥物通過上皮的滲透性。李秀艷等〔2〕研究指出殼聚糖磷脂膽堿復合物可能通過調節腦內乙酰膽堿代謝，提高AD大鼠腦內ACh含量，改善腦功能。本實驗研究殼聚糖磷脂酰膽堿(殼聚糖∶磷脂∶環糊精=2∶1∶0.33)對AD大鼠的抗炎治療作用。研究結果發現殼聚糖磷脂膽堿可以減少Aβ25～35誘導的AD炎性大鼠模型IKKβ和iNOS的陽性表達，能從行為學上改善AD大鼠的空間學習能力和認知能力。殼聚糖磷酯酰膽堿組比模型組大鼠找到平臺時間明顯縮短，單位時間內跨越原平臺次數和在原平臺象限停留時間較模型組明顯提高。這說明殼聚糖磷酯酰膽堿具有一定對抗AD大鼠腦海馬內炎癥反應、抑制小膠質細胞增生及改善AD大鼠的學習記憶能力的作用。本實驗屬于小樣本研究，其抗炎治療作用及機制還有待進一步大樣本研究。

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