低劑量雷帕霉素對糖尿病腎病大鼠nephrin表達的影響

鄒 琦 鄭祥雄 (福建醫科大學協和臨床醫學院腎內科，福建 福州 350001)

糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發癥之一，是以早期發生蛋白尿，隨后逐漸出現腎小球濾過率下降，并伴有腎小球硬化為特征。腎小球濾過屏障功能障礙可導致蛋白尿的發生。然而目前對于糖尿病腎病蛋白尿的發病機制尚未完全闡明。越來越多的證據表明足細胞對于腎小球濾過屏障選擇滲透性的改變起到重要的作用，隨著對足細胞研究的深入，也逐漸認識到足細胞在糖尿病腎病發病中的重要作用。本研究通過建立糖尿病腎病模型，觀察低劑量雷帕霉素對大鼠腎臟病理改變，以及足細胞特異的蛋白分子nephrin表達的影響，探討低劑量雷帕霉素能否通過維持足細胞結構完整而發揮對早期糖尿病腎病的腎臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級健康雄性SD大鼠(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)，體重200～250 g，生長良好，大鼠放置在通風良好，18～22℃恒溫環境中分籠飼養(每籠3只)，提供12 h交替照明，給予標準飼料及飲用水。將大鼠分為正常對照組(C組，n=7)，糖尿病組(D組，n=7)，雷帕霉素治療組(R組，n=8)。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠 nephrin(SANTA CRUZ，美國)，通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，TRIZON(Invitrogen，美國)，cDNA第一鏈合成試劑盒kit1(Fermentas，立陶宛)。

1.3 動物模型建立 大鼠禁食12 h后，予1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液按75 mg/kg一次性腹腔內注射。STZ注射72 h后，尾靜脈取血測血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模后第7、14、28天再次測血糖，仍符合上述標準者為穩定成模的大鼠，進入后續實驗，不符合者退出實驗。

1.4 實驗方法 第5周起R組大鼠按1 mg/kg體重給予0.3%雷帕霉素溶液每日灌胃給藥，C組和D組以相同體積0.5%羧甲基纖維素溶液灌胃，共干預8 w。所有大鼠在實驗期間均喂食標準飼料，自由飲水，不使用胰島素。各組大鼠喂養至12 w，處死前1 d將大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，以免食物殘渣污染尿液。收集大鼠24 h尿液。心臟穿刺抽血3 ml離心后取血清用于生化指標檢測;處死后取部分腎皮質在冰面上切修成1 mm的薄片置于3%戊二醛中，4℃固定，用于透射電鏡檢查;部分腎組織置于4%多聚甲醛固定24 h，用于免疫組化檢查;其余腎組織置于干燥EP管中，置入液氮中保存，用于RT-PCR檢測。

1.4.1 觀察指標 采用BCA法檢測24 h尿蛋白，采用全自動生化分析儀檢測血糖、血肌酐、尿肌酐，并通過公式計算內生肌酐清除率(Ccr)。Ccr(ml/min)=尿肌酐(mmol/L)×尿量(ml)/血肌酐(mmol/L)×1 440，體重校正的 Ccr〔ml·min－1·100 kg－1〕=Ccr/BW(g)×100，通過透射電鏡檢查足細胞超微結構。

1.4.2 免疫組化檢測 石蠟包埋切片常規脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶15 min，PBS沖洗3次，加血清封閉非特異抗體，予一抗(兔抗大鼠 nephrin 1∶100)4℃過夜孵育，滴加辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體，37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木素復染。PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡觀察并攝片。nephrin蛋白表達采用半定量分析，在高倍鏡下(400×)每張切片按順時針方向沿腎皮質隨機選取10個腎小球，分別攝片。應用圖像軟件分析系統(Image-Pro-Plus6.0)分別計算每個腎小球上nephrin表達的整合光密度(IOD)及相應的腎小球面積，兩者比值即為每個腎小球nephrin表達的腎小球陽性指數，取10個腎小球該比值的均數，即為每張切片nephrin陽性表達的腎小球指數。腎小球陽性指數=腎小球內各指標陽性表達整合光密度/相應腎小球面積。

1.4.3 RT-PCR檢測 取液氮中凍存的腎皮質約100 mg，在陶瓷研缽中研磨成粉末，用Trizol試劑標準程序提取腎皮質總RNA。紫外分光光度計測定260 nm和280 nm波長的A值，計算RNA濃度。取2 μg RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說明配制反應體系，進行逆轉錄合成cDNA。取1 μl模板cDNA，用nephrin、β-actin引物進行PCR擴增。引物由上海生工合成。1)nephrin:上游引物:5`-CGTCAGCATCAGCAGCAACC-3`，下游引物:5`-AGCCACATCTTCCAGCCTCTC-3`，擴增產物 72 bp;2)β-actin:上游引物:5'TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG 3'，下游引物:5'ACCGCTCATTGCCGATAGTG 3'，擴增產物348 bp。反應條件:94℃預變性 3 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃終末延伸5 min，共35個循環。取PCR產物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，利用凝膠成像系統進行陽性條帶吸光度積分掃描并記錄。用β-actin作為內參照校正，用目的基因的吸光度與β-actin的吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。計量資料用±s表示，方差齊者組間比較用LSD檢驗，方差不齊者用Games-Howell檢驗。

2 結果

2.1 觀察指標 12 w末，D組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白與C組比較明顯增多(P＜0.01)，R組大鼠體重校正的Ccr、24 h尿蛋白與D組比較明顯減少(P＜0.01)。見表1。

表1 12 w末各組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白比較(±s)

表1 12 w末各組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白比較(±s)

與C組比較:1)P＜0.01，與D組比較:2)P＜0.01

組別 n 血糖(mmol/L)體重校正的Ccr(ml·min －1·100 kg-1)24 h尿蛋白(mg/24 h)7 6.41±1.06 0.49±0.05 6.79±0.50 D組 7 30.63±0.981) 0.87±0.111) 98.81±3.601)R組 8 29.54±1.101) 0.68±0.142) 51.58±2.111)2)C組

2.2 腎組織超微結構檢查 透射電鏡下觀察，C組足細胞結構完整，足突形態細長、規則，排列整齊，基底膜無明顯增厚;D組見基底膜節段性增厚，足突排列不齊，可見足突增寬、融合，部分可見足突消失。R組上述改變較DN組減輕。見圖1。

圖1 電鏡下足細胞超微結構圖

2.3 腎組織免疫組化半定量分析 12 w末，D組大鼠nephrin蛋白表達較C組明顯減少(0.018 3±0.001 2 vs 0.081 1±0.004 1，P＜0.01)。R組大鼠nephrin蛋白表達與D組相比明顯增多(0.026 3±0.001 5，P ＜0.01)。見圖2。

圖2 12 w末各組大鼠腎小球nephrin的表達

2.4 RT-PCR檢測 12 w末，D組大鼠nephrin mRNA表達水平較C組明顯減少(0.342 2±0.025 2 vs 0.636 7±0.017 4，P＜0.01)。R組大鼠 nephrin mRNA表達水平較D組增多(0.432 3±0.019 7，P＜0.01)。見圖3。

圖3 各組大鼠腎小球nephrin mRNA的表達

3 討論

蛋白尿是糖尿病腎病的重要臨床表現。長期蛋白尿是慢性腎臟疾病腎功能損傷進展的獨立危險因素。減少尿蛋白排泄可延緩腎病的進展〔1，2〕。腎小球濾過屏障是由腎小球內皮細胞、腎小球基底膜、足細胞構成的。足細胞即腎小球臟層上皮細胞，是一類具有獨特結構及功能的細胞。足細胞的足突通過-α3β1整合素和肌營養不良蛋白聚糖黏附于腎小球基底膜(GBM)上〔3〕。相鄰足細胞的足突之間相互交錯形成直徑為30～40 nm的裂孔，孔上覆蓋一層厚4～6 nm的裂孔隔膜(SD)，水和小分子物質可以自由通過裂孔隔膜，但大分子的血漿蛋白不能通過。因此，足細胞與足突之間的裂孔隔膜成為阻止蛋白通過的最終屏障。當足細胞受損時，足突的正常結構發生改變，濾過膜完整性受到破壞，導致蛋白尿發生。

nephrin，CD2AP，podocin等多種蛋白質分子組成SD復合物，其中一些蛋白質分子在維持SD復合物結構和功能完整性方面發揮重要的作用。NPHS1的蛋白產物nephrin，僅在腎臟足細胞中表達〔4〕，nephrin與podocin相互作用，通過CD2相關蛋白(CD2AP)結合在細胞骨架上。Putaala等〔5〕研究發現，NPHS1失活的大鼠出現蛋白尿及部分足突消失;同樣，Orikasa等〔6，7〕研究也發現對大鼠注射抗nephrin抗體也可導致蛋白尿的發生。通過對微小病變腎病及嘌啉霉素腎病模型的研究發現nephrin mRNA低表達與蛋白尿發生呈負相關〔8，9〕nephrin與蛋白尿的產生密切相關，可推測nephrin對于維持腎小球濾過屏障的功能起重要作用。有研究證實糖尿病腎病中由于高血糖、糖化血紅蛋白及血管緊張素Ⅱ增多使nephrin表達下調〔10〕。本實驗結果顯示糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白排泄較對照組明顯增多，電鏡觀察提示糖尿病組大鼠出現足突增寬、融合，部分可見足突消失，免疫組化及RT-PCR半定量分析提示nephrin蛋白及mRNA表達均較對照組明顯減少。因此，由于糖尿病腎病時循環中的血糖、AGE、ANGⅡ、ROS、TGF-β等因素的增加均可誘發nephrin的表達下調，引起裂孔隔膜分子結構改變，導致足突形態變化，出現足突增寬、融合，使血漿蛋白通過的最終屏障被破壞，血漿蛋白漏出，產生蛋白尿，從而促進糖尿病腎病進展。

雷帕霉素臨床上作為免疫抑制藥用于腎移植患者抗排斥反應。近年的研究發現，雷帕霉素對某些慢性腎臟疾病可能具有治療的潛力。Torras等〔11〕通過建立兩種不同發病機制的腎病模型，發現雷帕霉素對于兩種腎病模型在腎臟損傷、蛋白尿排泄及足細胞損傷的影響具有兩種相反的作用，其可減輕慢性腎臟疾病的蛋白尿，并使nephrin的表達增加。本實驗可推測低劑量雷帕霉素可通過緩解高血糖等因素造成的足細胞損傷，維持裂孔隔膜結構完整而發揮腎臟保護作用。

蛋白尿的出現可加重糖尿病腎病的腎臟損害。近年來，越來越多證據表明足細胞對于糖尿病腎病早期腎臟結構和功能改變起重要作用。其中足突間的SD的完整性是使腎小球濾過屏障具有高度滲透選擇性的重要因素之一，SD損傷直接導致蛋白尿的發生。近年研究表明低劑量雷帕霉素可減輕蛋白尿的發生，對于慢性腎損傷，低劑量雷帕霉素可通過增加nephrin及podocin的表達，維持腎小球濾過屏障及足細胞結構完整性，使蛋白尿排出減少，從而延緩糖尿病腎病的進展。

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