SIRNA抑制PTTG表達對人結腸癌LOVO細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

王茂楠 夏 昕 徐松柏 劉玉石 (吉林省人民醫院，吉林 長春 3002)

近年來中國結腸癌的發病率呈上升趨勢，且以每年4%的幅度遞增，遞增速度為世界平均水平的2倍〔1～3〕。目前，結腸癌的治療方法主要以手術為主，輔以局部或全身放、化療，但未能明顯提高結腸癌的5年生存率，因此傳統的治療方法效果并不理想。近年來隨著分子生物學及基因工程的發展，使得應用基因治療成為提高結腸癌患者預后的一種有前景的途徑〔4～6〕。本研究通過RNA干擾技術對結腸癌LoVo細胞中PTTG進行抑制，并進一步觀察PTTG基因沉默對結腸癌LoVo細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人結腸癌LoVo細胞株為本研究室保存。陰性對照干擾質粒 pGenesil－2.1－HK siRNA，PTTG 干擾質粒pGenesil－2.1－PTTG siRNA由本室構建并保存;胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司(美國)，ECL發光試劑盒購自美國BD公司。

1.2 細胞培養和轉染 LoVo細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃，5%CO2培養箱中培養。細胞轉染采用陽離子脂質體介導法，按Lipofectamine 2000說明書進行。

1.3 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 干擾后 LoVo細胞中 PTTG 表達 采用Western blot法，ECL發光試劑盒檢測轉染48 h后3組細胞中PTTG蛋白表達。

1.4 pGenesil－2.1－PTTG siRNA對 LoVo細胞增殖的影響 取對數生長期細胞制備細胞懸液，調整細胞密度為2.5×104個/L，用無雙抗的DMEM培養基鋪于96孔板上，每孔200 μl(相當于5 000個細胞)。實驗分3組:正常對照組、陰性干擾質粒組和PTTG干擾質粒組，每組6復孔，轉染后放入37℃、5%CO2孵箱培養，于培養24、48和72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續孵育4 h。終止培養，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO振蕩，并于490 nm下用酶標儀檢測各孔光吸收值(A)。

1.5 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 對 LoVo 細胞凋亡和細胞周期的影響 將LoVo細胞用無雙抗的DMEM培養基鋪于6孔板上，分組同上。轉染后48 h收集細胞，1 200 r/min，離心5 min，0.01 mmol/L PBS洗兩次，RNA酶消化，PI(碘化丙腚)4℃避光染色30 min，以流式細胞儀(BD公司，USA)檢測細胞周期時相變化;用Annexin V－PI FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡變化，將LoVo細胞加入6孔板24 h后，轉染PTTG siRNA干擾質粒，同時設置正常對照及HK陰性對照組。連續培養48 h，收集細胞，每個樣本取5×105個細胞，加450 μl binding buffer重懸細胞，然后加入2 μl熒光標記的 Annexin V和5 μl PI，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測，細胞凋亡數據用Modfit軟件分析，記錄凋亡細胞百分率。

2 結果

2.1 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 干擾后 LoVo細胞中 PTTG 蛋白表達 如圖1所示，Lovo細胞轉染pGenesil－2.1－PTTG siRNA干擾質粒48 h后其內PTTG蛋白表達明顯低于正常和HK陰性對照組。

圖1 轉染PTTG siRNA質粒后LoVo細胞中PTTG蛋白表達(Western印跡)

2.2 pGenesil PTTG siRNA對LoVo細胞增殖的影響 MTT比色分析法顯示，pGenesil PTTG siRNA質粒轉染LoVo細胞后，在24、48和72 h細胞增殖能力均顯著低于正常對照組和陰性對照HK組(均P＜0.01)(表1)。

表1 轉染PTTG siRNA質粒后LoVo細胞增殖率變化(MTT法)(±s，n=6)

表1 轉染PTTG siRNA質粒后LoVo細胞增殖率變化(MTT法)(±s，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與HK組比較:2)P＜0.01;表2同

0.641±0.056 0.952±0.015 1.315±0.093 Lipo+HK組 0.612±0.0341) 0.813±0.0161) 1.287±0.091 Lipo+siRNA組 0.457±0.0771)2)0.549±0.0951)2)0.726±0.0181)2)24 h 48 h 72 h正常對照組組別

2.3 pGenesil PTTG siRNA質粒對LoVo細胞周期和凋亡的影響 流式細胞法檢測結果顯示，與對照組相比，轉染pGenesil－2.1－PTTG siRNA質粒后LoVo細胞G0/G1期細胞百分率均高于正常和陰性HK對照組(均P＜0.01)，而S期細胞百分率均低于正常和陰性HK對照組(均P＜0.01)，提示PTTG基因被干擾后可使LoVo細胞阻滯于 G0/G1期;Annexin V－PI雙染結果顯示，轉染pGenesil－2.1－ PTTG siRNA質粒后LoVo細胞凋亡百分率高于正常和陰性HK對照組(均P＜0.01)(表2)。

表2 pGenesil PTTG siRNA質粒對LoVo細胞周期和凋亡的影響(±s，n=4)

表2 pGenesil PTTG siRNA質粒對LoVo細胞周期和凋亡的影響(±s，n=4)

Apoptosis組別 G0/G1 S G2/M 49.66±4.14 47.69±4.37 2.66±1.88 13.56±3.82 Lipo+HK組 52.67±3.24 40.0±3.11 7.33±2.03 15.81±3.07 Lipo+siRNA3組60.97±4.381)2)35.58±5.971)2)3.55±2.16 50.29±1.281)2)正常對照組

3 討論

PTTG是一種強有力的腫瘤轉化基因，是一種細胞分裂后期的抑制因子，通過抑制分裂酶的活性抑制成熟前的染色體分裂。通過這一重要的功能，PTTG參與膠質瘤細胞的有絲分裂、細胞周期的進行、DNA修復、細胞凋亡幾個關鍵的活動〔7〕。PTTG在包括結腸癌等的大多數惡性腫瘤都有表達，且在正常組織中幾乎未見表達，其異常表達與多種腫瘤的發生、發展及侵襲進程密切相關，故是結腸癌基因治療的理想靶點之一〔8〕。沉默PTTG基因可能抑制腫瘤細胞過度增生狀態，降低腫瘤的增殖活性，在整體上調解腫瘤細胞狀態的同時也降低了某些癌基因的過度表達。本實驗結果也支持這樣的推斷。pGenesil PTTG siRNA組，干擾質粒表達出針對于PTTG mRNA的siRNA，對PTTG基因直接產生沉默效應，該轉染組的PTTG蛋白的表達受到明顯的抑制，從客觀上證明了筆者構建的干擾載體的有效性。

Pei〔9〕研究顯示 PTTG蛋白與 c－myc基因的接近轉錄起始位置的啟動子序列結合，并激活其轉錄，進而促進細胞增殖。這與本研究相一致。筆者發現，轉染pGenesil PTTG siRNA的LoVo細胞較未轉染組及空載體轉染組增殖速度降低。通過細胞周期分析，發現轉染pGenesil PTTG siRNA的LoVo細胞中，G0/G1期細胞所占比例明顯增加，而S期細胞所占比例明顯減少。pGenesil PTTG siRNA轉染可能通過降低PTTG的表達，使在結腸癌LoVo細胞發生周期阻滯，從而抑制結腸癌細胞增殖。但其具體機制尚有待于進一步研究證實。

Bernal等〔10〕使用噬菌體呈現技術篩選，證明在體內或體外PTTG蛋白表達通過抑制p53基因的轉錄激活來抑制p53基因在MCF－7細胞誘導凋亡。在肺癌細胞系H1299，過度表達PTTG導致對p53凋亡誘導作用的抑制，并抑制p53的下游基因表達，如Bax、SFN和CDKN1A，提示PTTG抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，將PTTG基因沉默后結腸癌LoVo細胞凋亡明顯增加，與對照組差異顯著，間接提示了PTTG與結腸癌細胞凋亡之間的關系，但其與結腸癌細胞凋亡是否與p53相關，且其機制尚有待進一步的研究。總之，針對PTTG的研究對明確結腸癌的發病機制以及改善結腸癌的治療均有重要意義。針對PTTG的基因治療，可能為結腸癌的治療提供新的策略。

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