順鉑對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞凋亡與自噬的影響

石 璐 蘇 靜 (長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校口腔教研室，吉林 長(zhǎng)春 3003)

順鉑(CDDP)是臨床常用的化療藥物，抗腫瘤效果主要源于其DNA損傷作用，引起細(xì)胞的凋亡〔1～3〕。目前認(rèn)為，由于血供減少，腫瘤細(xì)胞特別是腫瘤內(nèi)部細(xì)胞在乏氧和營(yíng)養(yǎng)受限的狀況下，自噬是腫瘤細(xì)胞受到損傷因素誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激條件下的一種保護(hù)性反應(yīng)〔4，5〕。使用自噬抑制劑或基因沉默自噬蛋白(Beclin 1或Atg5)，均可促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶(Caspases)活化和細(xì)胞凋亡發(fā)生。研究結(jié)果顯示自噬作為細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，可抑制CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活〔6〕。本研究通過體外培養(yǎng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞，初步探討CDDP對(duì)其凋亡和自噬的影響，為尋找新的治療舌鱗狀細(xì)胞癌的策略以及聯(lián)合用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞 CDDP和二甲基噻唑(MTT)購(gòu)自Sigma公司;Caspase-3，Cleaved Caspase-3，細(xì)胞色素 C(Cytochrome C)，人多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，白噬性溶酶體(LC3)，Beclin 1和p62抗體購(gòu)于Santa公司;人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株用含10% 胎牛血清(Gibco公司)的DMDM(Gibco公司)培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，胰酶消化傳代，隔2 d 1∶3傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control)以及不同劑量CDDP作用的實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 取出于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞消化離心后均勻的加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加150 μl約含(1～1.5)×104Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，使細(xì)胞完全貼壁。設(shè)立對(duì)照組以及不同濃度CDDP作用組，每個(gè)組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，作用24 h后，每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)孵育4 h后棄掉孔板中的培養(yǎng)液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，利用孔板振蕩器振蕩10 min，充分融解孔板內(nèi)結(jié)晶物。完全溶解后，在BIO-TEK酶標(biāo)儀上，選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔光吸收值，最后計(jì)算細(xì)胞增殖率。對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組存活率=(各濃度組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) CDDP作用后，收集細(xì)胞。預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，每瓶加入120 μl蛋白裂解液(RIPA)，充分混勻后利用細(xì)胞刮將細(xì)胞完全刮下后移入1.5 ml離心管中，放入4℃冰箱中作用45 min，然后低溫離心機(jī)離心，4 000 r/min離心20 min，收取上清，檢測(cè)蛋白濃度。取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(BSA，1 mg/ml)，用RIPA稀釋將其稀釋成0.1 mg/ml，將待測(cè)蛋白2 μl加入 200 μl Bio-Rad Assay Buffer，震蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)630 nm測(cè)量各孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組蛋白濃度。100℃蛋白變性，然后用加樣器緩慢加入變性后蛋白樣本。上樣完成后進(jìn)行電泳，上層膠90 V，15 min，下層膠 180 V，50 min，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，100 V，120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將完成轉(zhuǎn)膜的PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉30 min。封閉結(jié)束后用加入相應(yīng)一抗，4℃過夜。第二天，利用PBS洗膜3次，每次15 min中，加入相應(yīng)二抗，室溫1 h。然后PBS再洗膜3次，每次15 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，分析灰度值。然后將PVDF膜晾干后封存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，資料數(shù)據(jù)以±s表示，電泳條帶灰度值以灰度×面積/對(duì)照組表示。

2 結(jié)果

2.1 CDDP 對(duì)Tca8113細(xì)胞生存率的影響 與對(duì)照組相比(設(shè)為 1.00)，1.5、3、6、12、24 μg/ml CDDP 組 Tca8113 細(xì)胞生存率分別為(92.5±5.1)%、(78.3±6.8)%、(59.3±4.3)%、(42.1±3.9)%、(28.3±5.2)%。可見不同濃度CDDP可以明顯降低細(xì)胞的生存率(P＜0.05)。

2.2 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 CDDP可以明顯的增加活化的Caspase-3表達(dá)水平;同時(shí)CDDP還可以增加PARP活化片段的表達(dá)水平，明顯增加Tca8113細(xì)胞Cytochrome C表達(dá)水平(P＜0.01)。見圖1。

2.3 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western印跡檢測(cè)顯示，CDDP可以明顯增加LC3-Ⅱ以及Beclin 1蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，CDDP可以降低p62蛋白的表達(dá)水平。見圖2，圖3，圖4。

圖1 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞Cytochrome C蛋白表達(dá)的影響

圖3 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來口腔頜面部惡性腫瘤的發(fā)病率在逐年的升高，尤其是老年人更為嚴(yán)重，傳統(tǒng)的手術(shù)治療的方法往往不能達(dá)到預(yù)期的治療效果并且常常伴隨著復(fù)發(fā)，因此需要尋找新的治療策略。聯(lián)合療法是指在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)藥物進(jìn)行治療。CDDP是經(jīng)典的臨床化療藥物，其抗腫瘤機(jī)制是引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和殺傷腫瘤的效果。

本文中，MTT結(jié)果顯示CDDP可以抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞存活。進(jìn)一步Western印跡結(jié)果顯示，不同濃度的CDDP可以明顯增加凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和PARP活化片段的表達(dá)水平，提示CDDP可以誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞內(nèi)存在多少凋亡信號(hào)通路，其中線粒體信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)凋亡中發(fā)揮主要的作用〔7，8〕。Western印跡結(jié)果顯示，不同濃度的CDDP可以明顯增加胞漿內(nèi)Cytochrome C水平，提示CDDP可能通過線粒體凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

自噬是將胞質(zhì)成分(包括細(xì)胞器)包裹進(jìn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自體吞噬體中，最終與溶酶體融合而被降解的途徑。雖然自噬對(duì)于損傷細(xì)胞器等物質(zhì)的降解可以促進(jìn)處于應(yīng)激環(huán)境的細(xì)胞的存活，但是自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的影響還存在爭(zhēng)議。饑餓條件下，自噬可以通過降解細(xì)胞質(zhì)成分為細(xì)胞提供生產(chǎn)ATP和合成蛋白質(zhì)所需的原料，促進(jìn)細(xì)胞存活。而在凋亡缺陷的細(xì)胞中，自噬又是細(xì)胞發(fā)生壞死所必需的。一般認(rèn)為，自噬通過降解損傷的細(xì)胞器或者長(zhǎng)壽命蛋白來維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，促進(jìn)細(xì)胞的存活。但是，近來的研究顯示自噬對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)存在雙重作用，特別是在抗腫瘤藥物引起的細(xì)胞死亡中的作用越來越受到人們的關(guān)注〔9〕。有報(bào)道稱，CDDP可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。LC3，Beclin1和 p62是檢測(cè)自噬最常用的標(biāo)志性蛋白〔10〕，本文中Western印跡結(jié)果提示CDDP可以誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞發(fā)生自噬。

綜上所述，CDDP在誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但是自噬在CDDP誘導(dǎo)的凋亡中的作用還不是很清楚，需要進(jìn)一步的探討。聯(lián)合CDDP和自噬抑制劑可能成為治療人舌鱗狀細(xì)胞癌的新的策略。

圖4 CDDP對(duì)Tca8113細(xì)胞p62蛋白表達(dá)的影響

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