RGD活性肽對環磷酰胺誘導HL7702正常肝細胞損傷的保護作用

張 良 韓 丹 趙詩萌 吳紅敏 (中國醫科大學附屬第一醫院新生兒科，遼寧 沈陽 110001)

廣譜抗腫瘤藥物環磷酞胺(CTX)屬潛伏氮芥類烷化劑，可誘導產生染色體變異，導致細胞周期、形態、生理等方面發生改變，但其缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也破壞機體的正常細胞。腫瘤抑素30肽(T30)是含有多個精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的抗腫瘤多肽〔1〕，具有專一作用于腫瘤細胞的功能，對正常細胞沒有殺傷;可以促進多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，與化療藥物CTX聯合應用具有明顯的抗腫瘤疊加作用。至今RGD多肽對于CTX導致的正常細胞損傷的影響沒有報道。本研究觀察T30肽對CTX誘導的HL7702凋亡是否具有抑制作用，為靶標的抵抗化療損傷藥物研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料 HL7702由日本醫科大學生命科學研究中心提供。水溶性四氮唑(WST-1)凋亡檢測試劑盒購自碧云天，錨定蛋白-異氰硫酸熒光素-碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自凱基生物科技;EB、AO購自羅氏。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養液中，置37℃，5%CO2培養箱中培養，2～3 d傳代1次。

1.2.2 繪制細胞生長曲線 將對數生長期的HL7702細胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI1640培養液吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為1×104/ml，每孔100 μl分別加入到4塊96孔培養板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養。24 h細胞貼壁后，向各孔中分別加入 CTX(濃度為4 μg/ml)、CTX+RGD-T30(濃 度 依 次 為 20、40、60、80、100 μg/ml，每個濃度設5個復孔)。分別培養24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，各孔加入100 μl無血清培養基和10 μl WST-1，繼續在37℃，5%CO2飽和濕度培養箱培養1 h。酶標儀測定各孔光密度(OD值)，空白孔調零，選擇450 nm為測定波長，630 nm為參考波長，以藥物濃度為橫坐標，OD為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復三次，確定結果穩定性。

1.2.3 AO/EB雙染色實驗 24孔板按5×104個細胞/孔密度接種細胞懸液，培養24 h后向各孔中分別加入CTX(濃度為4 μg/ml)，CTX+RGD-T 30(濃度依次為 20、40、60 μg/ml)，繼續培養24 h，棄去培養基，PBS清洗2遍，每孔分別加200 μl AO染液(100 μg/ml)及 200 μl EB 染液(100 mg/L)，室溫放置5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理方法同上，PBS清洗細胞2次，0.25%胰酶消化細胞，500 g離心5 min收集細胞。收集1×106單細胞懸液.，加入Binding buffer 100 μl 和 Annexin-V-FITC(20 μg/ml)10 μl，室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/ml)5 μl，用 Binding buffer加至 400 μl，用碘化丙錠染色流式細胞術(FACS)進行定量檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量數據以±s表示，組間比較采用獨立樣本的t檢驗。

2 結果

2.1 RGD-30T對CTX誘導的HL7702生長抑制的影響 在單獨存在CTX時，HL7702均處于生長抑制狀態，當加入 RGDT30肽時，實驗組細胞生長抑制明顯改善，并隨著RGD多肽濃度的增加，450 nm波長處的吸光值呈上升趨勢，呈現出濃度依賴性，即細胞生長速度增加，T30 肽濃度為 20、40、60、80、100 μg/ml時 OD 值分別為 0.184 ± 0.03、0.192 ± 0.041、0.372±0.091、0.579±0.175、0.613±0.216。當 T30肽濃度達到40 μg/ml時，促進生長作用顯著增加，各組與陰性對照組比較具有統計學意義。T30肽濃度在20～40 μg/ml時，這種保護作用呈平臺期特征。結果顯示，T30肽對CTX誘導的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

2.2 RGD-30T對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態的影響單獨應用CTX組，絕大部分細胞核被染成橙紅色，核皺縮或碎裂，為晚期凋亡或死亡細胞。T30肽與CTX聯合應用時，T30肽強烈抑制了CTX對HL7702的損傷作用，凋亡細胞明顯減少，絕大多數細胞形態飽滿，幾乎沒有死亡細胞。AO/EB染色實驗結果表明，從形態角度觀察，RGD-T30對 CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態具有抑制作用。見圖1。

圖1 不同濃度T30肽與HL-7702細胞的保護作用

2.3 RGD-30T對CTX誘導的HL7702細胞凋亡的影響 Annexin-V-FITC/PI染色，CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h晚期凋亡細胞占30.2%，CTX與T30共處理細胞組凋亡細胞分別占19.2%和13.1%、7.1%。可見，隨著T30肽濃度增加，凋亡細胞逐漸減少，活細胞和早期凋亡細胞明顯增多。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h早期凋亡細胞占57.2%，CTX與T30共處理細胞組凋亡細胞分別占29.7%和17.1%、9.5%。可見，隨著T30肽濃度增加，早期凋亡細胞逐漸減少，活細胞明顯增多。

3 討論

惡性腫瘤的治療手段有多種，化療仍是目前極為重要的基本手段之一〔2〕，但其靶向性差。多數抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細胞的同時無選擇地破壞正常組織，廣泛而嚴重的急性和慢性化療損傷，限制了在癌癥治療中的作用〔3〕。因此在抗腫瘤治療時，能達到最大殺傷腫瘤細胞并對正常組織產生最小破壞作用的臨床目的已經成為化療藥物臨床應用目標。這方面的研究也是當今抗腫瘤藥物研究與開發領域的一大熱點〔4〕。

Arap等〔5〕獲得了能特異性和腫瘤新生血管結合的小肽RGD，將其與具有抗血管形成作用的常規化療藥物阿霉素交聯，發現導向性的阿霉素可以使人乳腺癌移植瘤小鼠存活時間明顯延長，且毒副反應降低。目前研究發現，含有RGD序列的蛋白或肽，與整合素結合，參與細胞的分化、增殖、凋亡、黏附、形態發生等生物學過程，在組織器官發生、創傷修復及腫瘤的發生、浸潤轉移等生理和病理過程中發揮重要作用〔6〕。腫瘤抑素27肽與RGD活性三肽〔7〕結合后形成T30肽，具有更強的抑制血管新生抗腫瘤作用〔8〕，在與CTX的實驗中發現，T30肽與CTX協同抗腫瘤時，不僅可以增強CTX的抗腫瘤作用，同時，可能有效的抑制CTX對正常細胞帶來的損傷作用。通過HL7702細胞進一步證實這一現象。本實驗結果表明，含RGD的抗腫瘤活性肽T30肽在濃度達到40 μg/ml時，不僅可以增加CTX對腫瘤細胞的抗腫瘤作用，同時又能抵抗因使用 CTX對HL7702正常肝細胞損傷的保護作用。為今后相對降低CTX用藥劑量，降低治療成本，同時又能夠降低用CTX帶來的毒副作用，顯示出良好的應用前景。

CTX是臨床應用最普遍的光譜抗腫瘤化療藥物之一，T30肽在近年來也有大量文獻報道其抗腫瘤作用，但未見其與化療藥物聯合應用促進腫瘤細胞凋亡的同時對正常細胞的保護作用。為探求RGD-T30對于CTX損傷HL7702細胞保護作用的研究中，考慮到WST-1細胞增殖試驗，這是一種檢測細胞存活和生長的方法。WST-1是一種類似于噻唑藍(MTT)的化合物，是MTT的一種升級替代產品，和MTT或其它MTT類似產品如XTT、MTS等相比有明顯的優點。首先WST-1和XTT、MTS產生的formazan都是水溶性的，可以省去后續的溶解步驟。其次，WST-1性質比XTT和MTS更加穩定，使實驗結果更加穩定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。故實驗結果更加精確可信。

在本研究發現在HL7702細胞培養液中分別加入CTX肽和不同的T30肽(0～100 μg/ml)培養24 h，細胞的增殖抑制在T30肽濃度達到20 μg/ml后得到改善，T30肽濃度達到40 μg/ml后具有明顯的劑量依賴性，同樣AO/EB雙染實驗和Annexin-V-FITC/PI流式細胞實驗也支持這一實驗結果。

在本研究中，首次發現含RGD序列的抗腫瘤多肽具有對CTX引起的正常細胞損傷的保護作用，但本結果僅提示含RGD抗腫瘤多肽全長具有此保護作用，因工作沒有涉及不含RGD的多肽對CTX引起的正常細胞損傷是否同樣具有此保護作用，所以還不能明確此保護作用完全來自于RGD序列。這也是進一步工作的研究方向。

1 Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk〔J〕.Ann Stomatol(Roma)，2012;3(1):31-6.

2 Wu M，Kelley MR，Kent Hansen W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001;280(4):755-61.

3 Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells〔J〕.Cancer Res，2000;60(18):5187-95.

4 馬培奇.細胞保護劑氨磷汀及其臨床應用及展望〔J〕.中國腫瘤，2001;10(8):471-2.

5 Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumo vasculature in a mouse model〔J〕.Science，1988;279(5349):377-80.

6 Li S，Wei J，Yuan L，et al.RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 cells through the αvβ3 pathway〔J〕.Cancer Biother Radiopharm，2011;26(5):529-38.

7 Wu ZZ，Li P，Huang QP，et al.Inhibition of adhesion of hepatocellular carcinoma cells to basement membrane components by receptor competition with RGD-or YIGSR-containing synthetic peptides〔J〕.Biorheology，2003;40(4):489-502.

8 Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis〔J〕.Methods，2009;48(2):188-92.