細胞因子對人食道鱗癌細胞的體外殺傷作用

賀 偉 劉玉俠(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 30003)

免疫治療已成為惡性腫瘤繼手術、化療、放療后第四大治療方式。細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞因體外增殖速度快、抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣、可以調節并增強機體的免疫功能等優勢逐漸成為研究的熱點〔1〕。本實驗通過體外誘導培養CIK細胞對人食道鱗癌細胞(ESCC)Ecap-109的體外殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 IMDM培養基，GIBCO公司;IFN-γ，上海凱茂生物醫藥有限公司;IL-1α，Peprotech公司;CD3Ab，RD公司;IL-2，北京四環生物制藥有限公司;FCS，天津TBD公司;MTT購自 Sigma;抗人 CD3-FITC，抗人 CD16、CD56-PE，BD 公司。ESCC Ecap-109購于上海生物細胞研究所。超凈工作臺，上海金帆空氣凈化工程公司;低溫高速離心機，CO2恒溫細胞培養箱，美國科峻公司;全自動酶標儀，芬蘭雷勃公司。

1.2 外周血單核細胞的分離、培養 用淋巴細胞分離液分離人外周血單核細胞，計數細胞數為1×106/ml，加入細胞培養瓶，放入37℃，5%CO2培養箱培養。

1.3 CIK細胞的誘導、培養 將分離培養的外周血單核細胞加入 IFN-γ 1 000 U/ml，CD3Ab 100 ng/ml，IL-1α 1 000 U/ml，IL-2 1 000 U/ml，3 d后換液，同時補加IL-2。

1.4 CIK細胞表型的測定 將誘導培養的CIK細胞用FITC標記的CD3Ab、PE標記的CD16、CD56Ab標記CIK細胞，用流式細胞儀測定CD3+CD16+CD56+細胞的表達。

1.5 Ecap-109細胞的培養 將Ecap-109用含10%IMDM的培養基培養至對數生長期，用0.25%胰酶消化后離心洗滌，調細胞數為5×104/ml，接種到96孔細胞培養板。

1.6 CIK細胞對Ecap-109殺傷活性測定 將培養的CIK細胞調細胞數為2.5×106/ml和1.25×106/ml，按以下設計加入到已接種Ecap-109的細胞培養板內，每組設6復孔。Ecap-109對照組、CIK1對照組(2.5×106/ml);CIK2對照組(1.25×106/ml);CIK1+Ecap-109組(50∶1);CIK2+Ecap-109組(25∶1);培養24 h。培養結束前4 h加入MTT，用酶標儀在292 nm處 測 OD 值。 殺 傷 活 性 =

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 CIK細胞表型測定結果 CD3+CD16+CD56+表達為74.3%。見圖1。

圖1 CIK表型測定結果

2.2 CIK細胞對Ecap-109細胞殺傷活性 隨著CIK細胞數量的增加，對腫瘤細胞的殺傷力更強(50∶1＞25∶1，P＜0.05)。見表1。

表1 CIK細胞對Ecap-109細胞殺傷活性(n=6，±s)

表1 CIK細胞對Ecap-109細胞殺傷活性(n=6，±s)

與CIK2+Ecap-109組比較:1)P＜0.05

組別 OD值 殺傷率(%)0.694±0.024 －CIK1組 1.495±0.039 －CIK2組 1.031±0.020 －CIK1+Ecap-109組 1.532±0.0931) 94.81±3.901)CIK2+Ecap-109組Ecap-109組1.180±0.059 78.26±8.57

3 討論

目前研究較多的抗腫瘤免疫效應細胞主要包括淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞〔2〕、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)〔3〕、抗CD3抗體激活的殺傷細胞(CD3AK)〔4〕、CIK等，但 LAK細胞、TIL等的抗腫瘤活性較低，限制了其在臨床的應用〔5〕。

CIK細胞是將人外周血單核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞。由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。應用CIK細胞被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。

CIK細胞同時表達多種細胞因子受體，且多項體內模型顯示，CIK細胞經靜脈回輸體內后可以遷移至腫瘤部位。在腫瘤局部，CIK細胞可以發揮細胞毒作用，控制腫瘤的生長。與其他抗腫瘤效應細胞相比CIK細胞具有體外增殖速度快、抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣、毒性作用小等優點〔1，6〕。此外，CIK 細胞還可以調節并增強機體的免疫功能〔7〕。因此，CIK細胞過繼性免疫治療逐漸成為實體腫瘤或血液系統腫瘤治療的新選擇，逐漸成為研究的熱點。本實驗表明CIK細胞對腫瘤細胞的強大殺傷力。表明在臨床應用時CIK細胞要達到一定的細胞數量，以保證治療效果。

1 Hontscha，Borck Y，Zhou H，et al.Clinical trials on CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC)〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011;137(2):305-10.

2 Rosenberg S.Lymphokine-activated killer cells:a new approach to immunotherapy of cacer〔J〕.J Natl Cancer Inst，1985;75(4):595-603.

3 Rosenberg SA，Spiess P，Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes〔J〕.Science，1986;233(4770):1318-21.

4 Yun YS，Hargrove ME，Ting CC.In vivo antitumor activity of anti-CD3 induced activated killer cells〔J〕.Cancer Res，1989;49(17):4770-4.

5 Shablak A，Hawkins RE，Rothwell DG，et al.T cell-based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma:modest success and future perspective〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(21):6503-10.

6 Sehmidt-Wolf IG，Negrin RS，Kiem HP，et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity〔J〕.J Exp Med，1991;174(1):139-49.

7 Sehmidt-Wolf IG，Lefterova P，Nehta BA，et al.Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells〔J〕.Exp Hematol，1993;21(13):1673-9.