白地霉提取凝血質對衰老模型大鼠血栓形成的診斷

劉詩音 王 莘 (吉林農業大學生命科學院，吉林 長春 130118)

血栓形成傾向與血液中凝血質的含量相關，臨床研究亦發現，老年血栓病患者血漿凝血質濃度明顯增高，且抗原水平和活性明顯高于正常人〔1〕，血液中凝血質含量是動脈血栓形成的關鍵環節〔2〕。在血液中加入凝血質，通過計算凝血時間診斷血栓形成，方法簡單。目前只有在單核細胞中細菌脂多糖類人工誘導合成凝血質。本文利用白地霉發酵提取純化凝血質，對預防、診斷血栓疾病提供了新的藥物來源途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 白地霉:吉林農業大學生命科學學院生物工程實驗室提供。SD大鼠:體重250～280 g，30只，雌雄各半。由長春市生物制品研究所提供。

1.2 試劑 D-半乳糖，FeCl3，Sephadex G-200。

1.3 方法

1.3.1 白地霉發酵提取純化凝血質 PDA培養基，搖瓶發酵，收集菌絲體，凍干，－4℃冰箱中保藏。白地霉菌絲體(乙醇浸提，先38℃ ～50℃，后30℃以下)，提取液濃縮 (硫酸鈉脫水)，膏狀物 (乙醚提取)，乙醚濾液 (濃縮)，濃縮液 (丙酮沉淀)，沉淀物 (凝血質粗制品)Sephadex G-200純化得凝血質純品。

1.3.2 動物實驗 將20只 SD大鼠，每天予 D-半乳糖0.125 g/kg皮下注射共40 d構建大鼠衰老模型。之后分成年老空白組及年老血栓誘導組，每組雌雄各5只。血栓誘導組用5%FeCl3溶液誘導血栓生成。24 h后，將30只大鼠分為青壯組，年老組及年老血栓誘導組分別用斷尾取血方法取血一大滴滴到載玻片上，迅速滴加5 μl、0.1 g/ml濃度凝血質溶液，傾斜載玻片計時。用針尖每5 s劃一次血液，當出現絲狀物，計時停止，對比各組凝血時間。

2 結果

2.1 凝血質純化 白地霉發酵提取的粗蛋白經純化后，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，純化蛋白質與marker在同一條帶上，分子量為47 kD左右。見圖1。

圖1 凝血質純化蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 各組體外凝血時間 青壯組最高凝血時間為41 s，最低凝血時間為37s，平均凝血時間為39 s。老年組最高凝血時間為39 s，最低凝血時間為29 s，平均凝血時間為34 s;其中4只大鼠凝血時間與其他大鼠凝血時間有較大差距，分別為29、30、30、29 s，平均凝血時間為29 s、年老誘導血栓組最高凝血時間為27 s，最低凝血時間為24 s，平均凝血時間為25 s。

2.3 觀察大鼠體內血栓的形成 青壯組經觀察1個月，體內均未出現血栓;老年組，凝血時間較低的4只大鼠3 d后體內出現血栓;年老誘導血栓組24 h內10只大鼠均因血栓死亡。

3 討論

凝血質為胞內蛋白，在提取純化過程中，要保證其酶活性，嚴格控制反應溫度。因為雜蛋白較多，在提取純化過程中，需要較高的條件。

研究衰老機制、老年病需要可靠的衰老模型。復制衰老模型的依據是目前公認的幾種衰老學說。D-半乳糖致衰老模型是我國學者基于衰老的代謝學說而復制的衰老模型，該模型系在一定的時間內給動物連續注射D-半乳糖，使其細胞內半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，后者不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終機體衰老〔3〕。

動物血栓模型的制作基本遵循Virchow提出的血栓形成的經典原理。對血液進行體外凝血實驗，檢測凝血時間，可根據凝血時間診斷是否會有血栓生成，為今后預防、診斷血栓疾病提供了新的藥物來源途徑。

1 Banai S，Gertz SD.Tissue factor as therapeutic target in coronary syndromes〔J〕.Am J Cardiol，2001;87:763-5.

2 Moreno PR，Palacios IF，Leon MN，et al.Histopathologic comparison of human coronary in-stent and post-balloon angioplasty restenotic tissue〔J〕.Am J Cardiol，1999;84:462-6.

3 Song X，Bao M，Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouseaging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(3):239-51.