油菜菌核病菌拮抗海洋細菌GM－1菌株的種類鑒定及抑菌作用研究

葛平華， 馬桂珍， 付泓潤， 暴增海， 王淑芳， 劉兆普

（1.南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇海洋生物重點實驗室，南京 210095；2.淮海工學院海洋學院，連云港 222005）

油菜菌核病（rape sclertiniose）是由子囊菌亞門真菌核盤菌［Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Ba－ry］引起的世界性病害，是油菜生產中的重要病害之一，一般年份發病率高達10%～30%，嚴重的年份達80%以上［1－3］，因此油菜菌核病的防治一直受到重視。目前油菜菌核病的防治主要依靠化學防治，但化學防治導致環境污染以及菌株抗藥性形成等問題，限制了化學農藥的使用。而生物防治可彌補化學防治的不足，日益受到人們的重視，多種有益微生物用于油菜菌核病的防治，取得了顯著的防治效果［4－6］。郭春燕等篩選得到一株海洋細菌Bacillus velezensis DM09，在離體試驗中該菌發酵液對油菜菌核病的防效達92.51%［7］。李國慶、姜道宏等深入研究了盾殼霉對油菜菌核病的防治作用，研究表明盾殼霉分生孢子能夠在油菜花瓣上定殖［8］，并且盾殼霉可直接與復合肥混合使用，對油菜菌核病有明顯的抑制作用［9］。本試驗從連云港海域海水中篩選得到1株對油菜菌核病菌拮抗作用較強的海洋細菌GM－1菌株，對該菌株進行了種類鑒定和抗菌作用研究，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）由本研究室保存并提供；GM－1菌株由本實驗室從連云港海域海水中分離獲得。

1.2 盆栽用土與供試種子

取油菜田土，滅菌備用。供試油菜種子由種子公司購買。

1.3 培養基

油菜菌核病菌培養和抑菌試驗用PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；海洋細菌GM－1菌株培養用2216E培養基：蛋白胨5g、酵母粉1g、瓊脂15～20g、陳海水1000mL。油菜菌核病菌固體菌種培養基：麥麩與等量的PD培養液（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL）混勻。

1.4 GM－1菌株的種類鑒定

1.4.1 GM－1菌株形態特征觀察

將菌株GM－1接種于LB培養基平板上，28℃恒溫培養24h，觀察記錄菌落形態，并進行革蘭氏染色、芽胞染色、鞭毛染色。

1.4.2 生理生化試驗

生理生化試驗參考文獻［10］的方法，主要測定吲哚試驗、M.R.試驗、V.P.試驗、硫化氫試驗、石蕊牛奶試驗、接觸酶試驗、糖醇發酵試驗、半固體瓊脂穿刺試驗、好氧性和明膠液化等生理生化指標。

1.4.3 16SrDNA序列的擴增分析

GM－1菌株基因組DNA的提取參考Kingston等［11］的方法。

采用細菌16SrDNA基因通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）［12］。PCR 擴 增條件為94℃預變性4min；94℃變性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min30s，35個循環；72℃延伸10min。采用1.0%瓊脂糖對PCR擴增產物進行電泳檢測。將PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務公司測序。經測序獲得GM－1菌株16SrDNA序列提交NCBI數據庫，應用BLAST程序與數據庫中已有的細菌16SrDNA序列進行相似性比較，采用MEGA5軟件包 Neighbour－joining（bootstrap1000）法進行序列同源性分析，構建系統發育樹。

1.4.4 gyrB基因序列的擴增分析

采 用 通 用 引 物 UP－1（5′－GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGGNGGNAARTTYGA－3′）和 UP－2 （5′－AGCAGGCTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCKTCNGTCAT －3′）［13］進行gyrB基因序列擴增，擴增條件為95℃預變性5min，94℃1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環，72℃10min［14］。擴增產物送上海生工生物工程技術服務公司測序。應用BLAST程序與數據庫中已有的細菌gyrB序列進行相似性比較，采用MEGA5軟件包 Neighbour－joining（bootstrap1000）法進行序列同源性分析，構建系統發育樹。

1.5 GM－1菌株對油菜菌核病菌的抑制作用

1.5.1 GM－1菌株對油菜菌核病菌菌核萌發的影響

選取大小基本一致的菌核，用0.1%升汞溶液（W／V）浸泡菌核1min、75%乙醇溶液（V／V）浸泡菌核3～4min進行表面消毒，無菌水浸洗3～4次，用無菌濾紙吸干表面水分。將表面消毒的菌核在GM－1菌株菌液和無菌發酵液中浸泡24h，擺放在PDA平板上，每平板5粒菌核，共20個平板。28℃恒溫培養，定期觀察菌核萌發情況，計算菌核萌發的抑制率。以無菌水處理為對照。

1.5.2 GM－1菌株及無菌發酵液對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用

GM－1菌株對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用采用平板對峙法［15］。在PDA培養基平板中央接種直徑為8mm油菜菌核病菌菌苔，在菌苔周圍距離培養皿邊緣1.5cm處劃線接種GM－1菌株，于28℃倒置恒溫培養，重復3次。5d后觀察油菜菌核病菌菌落生長狀態，測量菌落直徑，計算抑菌帶寬度；挑取抑菌圈交界處的菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲細胞形態，以正常菌絲為對照。

菌株GM－1無菌發酵液對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用采用牛津杯法［16］。將油菜菌核病菌菌苔（8mm）接種在PDA平板中央，菌苔周圍對稱放置牛津杯，牛津杯中加入無菌發酵液200μL，重復3次。28℃恒溫培養5d，觀察菌落生長狀態，測定抑菌帶寬度，并挑取抑菌圈交界處菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲細胞形態，以正常菌絲為對照。

1.6 GM－1菌株促生及防治油菜菌核病的盆栽試驗

1.6.1 種子催芽試驗

將飽滿的油菜種子在GM－1菌株發酵液中浸泡4h，取出后擺放于鋪有濕潤濾紙的培養皿內，每皿30粒，重復3次，以無菌水和培養液分別為對照CK1和CK2，28℃恒溫培養72h，檢查油菜種子的發芽數，計算發芽率，測量發芽種子的根長。

1.6.2 盆栽防病試驗

采用灌根法［17］。將油菜菌核病菌的固體培養物按照每盆15g接入到裝有無菌土的花盆中，室溫放置4d。用GM－1菌株發酵液（100mL／盆）浸濕土壤后每盆播種10粒油菜種子，以無菌水浸濕土壤為對照CK1、培養液浸濕土壤為對照CK2，每處理10盆。播種15d后記錄各處理發病株數、測量株高及苗株干重。并按以下公式計算發病率和防治效果：

2 結果與分析

2.1 海洋細菌GM－1菌株的種類鑒定

2.1.1 海洋細菌GM－1菌株的形態特征

GM－1菌株在LB固體培養基上培養24h，菌落呈圓形、隆起、乳黃色、不透明、邊緣不整齊、表面濕潤不光滑、生長后期菌落顏色變深。細胞呈桿狀，G＋，單個排列也有鏈狀排列（圖1a），有芽胞、中生（圖1b），極生單鞭毛（圖1c），無莢膜（圖1d）。

圖1 細菌GM－1細胞形態（10×100）Fig.1 Cell morphology of the strain GM－1（10×100）

2.1.2 海洋細菌GM－1菌株的生理生化試驗結果

菌株GM－1可利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、木糖醇等糖醇進行發酵，不能利用木糖、阿拉伯糖、肌醇；并且吲哚試驗、M.R.試驗、V.P.試驗、接觸酶試驗、丙二酸鹽呈陽性，42℃可生長，好氧且具有運動性；在大分子試驗中，菌株GM－1的石蕊牛奶試驗、明膠液化試驗和淀粉水解試驗均顯陽性，結果見表1。

表1 細菌GM－1菌株的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical test results of the antagonistic strain GM－1

通過細菌形態學觀察和一系列的生理生化試驗，參照《伯杰細菌鑒定手冊》［18］發現 GM－1菌株符合芽胞桿菌的特性，屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）。

2.1.3 GM－1菌株16SrDNA序列分析

GM－1菌株16SrDNA序列PCR擴增產物測序得到大小為1455bp的片段。將該序列在GenBank中進行比對，結果顯示，GM－1菌株與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）的相似性均達98%以上。選取GenBank中相似性較高的模式菌株序列，采用MEGA5軟件構建系統發育樹，GM－1菌株與芽胞桿菌屬中B.amyloliquefaciens在同一分支，菌株GM－1可能屬于芽胞桿菌屬的B.amyloliquefaciens，結果見圖2。在現代微生物分類學上，16SrDNA序列已廣泛地應用于研究細菌的系統發育關系。然而，在芽胞桿菌屬枯草芽胞桿菌組中，不同菌株的16SrDNA序列相似性都超過了97%。因此，單純依據16SrDNA序列并不能將菌株GM－1準確鑒定到種的水平。

2.1.4 GM－1菌株gyrB基因序列分析

gyrB基因是編碼DNA促旋酶B亞基的基因。作為一種新的分子標記，該基因序列有比16SrDNA高得多的堿基替換頻率，并且在細菌中普遍存在其近乎呈單拷貝形式，目前在細菌種級水平的鑒定方面具有較強的可行性［19－20］。

GM－1菌株gyrB基因序列PCR擴增產物經測序得到大小為1213bp的片段。BLAST結果表明，GM－1菌株與B.amyloliquefacien的相似度最高，為99%。采用MEGA5軟件構建的系統發育樹，GM－1菌株和B.amyloliquefaciens位于同一分支上，這一結果與基于16SrDNA序列分析的結果一致，結果見圖3。結合形態學、生理學和分子證據，菌株GM－1應該屬于B.amyloliquefaciens。

圖2 GM－1菌株16SrDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence of GM－1

圖3 GM－1菌株gyrB序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrBsequence of GM－1

2.2 GM－1菌株和發酵液對油菜菌核病菌的抑制作用

2.2.1 GM－1菌株和發酵液對油菜菌核病菌菌核萌發的抑制作用

表2、圖4顯示，原發酵液和無菌發酵液對油菜菌核病菌菌核的萌發有明顯的抑制作用，培養1d抑制率都達到100%，3d抑制率分別為100%和90%，5d抑制率分別為100%和4%。結果表明，菌液對菌核的萌發具有很強的抑制作用，而無菌發酵液隨著時間的延長抑制作用逐漸減弱。

2.2.2 GM－1菌株對油菜菌核病菌菌絲的抑制作用

GM－1菌株和無菌發酵液對油菜菌核病菌菌絲的生長具有明顯的抑制作用，培養7d的抑菌帶寬度分別達到30mm和16mm，見圖5。

表2 GM－1菌株和發酵液對油菜菌核病菌菌核萌發的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the strain GM－1and sterile fermentation broth on sclerotia germination of S.sclerotiorum

圖4 GM－1菌株對油菜菌核病菌菌核萌發的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of the strain GM－1on sclerotia germination of S.sclerotiorum

圖5 GM－1菌株和無菌發酵液對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the strain GM－1and sterile fermentation broth on mycelium growth of S.sclerotiorum

圖6顯示GM－1菌株和無菌發酵液對菌絲結構有明顯的破壞作用，導致菌絲細胞壁變厚、膨大，細胞空洞、原生質分布不均勻。

2.3 GM－1菌株促生及防治油菜菌核病的盆栽試驗

2.3.1 種子催芽試驗

經GM－1菌株發酵液處理后油菜種子發芽率為98.9%，高于無菌水和培養液對照處理的93.3%和91.1%，且差異均達到顯著水平（表3）。

圖6 菌株GM－1對油菜菌核病菌菌絲細胞的抑制作用顯微觀察結果（10×20）Fig.6 Inhibitory effects of the strain GM－1on mycelium growth of S.sclerotiorum （10×20）

表3 GM－1菌株發酵液對油菜種子萌發的影響1）Table 3 Effects of the sterile fermentation broth of the strain GM－1on germination of rape seeds

處理后的油菜種子發芽后的平均根長為14.01mm，顯著高于對照。試驗中觀察到，處理的種子根部比對照明顯粗壯，且根尖無黃化現象，說明GM－1菌株對油菜種子的萌發生長有一定的促生作用。

2.3.2 盆栽防病試驗

采用灌根法進行盆栽試驗結果表明，GM－1菌株對油菜植株生長表現出明顯的促生作用。經該菌發酵液處理后油菜幼苗株高為6.44cm，顯著高于無菌水和培養液處理的對照；處理的發病率明顯低于對照，發酵液的防病效果達到68.0%（表4）。

表4 盆栽防病試驗結果Table 4 The control effects of the strain GM－1 on S.sclerotiorumby pot tests

試驗中無菌水處理的CK1的發病率為52.6%，明顯低于用培養液處理的CK2，導致這一結果的原因可能是由于培養液利于油菜菌核病菌的生長和侵染，因而CK2的發病率較高。

3 結論與討論

通過形態特征觀察、生理生化試驗及16SrDNA序列、gyrB基因序列分析，將GM－1菌株鑒定為芽胞桿菌屬的解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。

近年來Biolog、16SrDNA的序列分析等方法已廣泛應用于細菌的鑒定［21］，對多數細菌的鑒定發揮著重要作用，但對于相近種類難以進行準確鑒定，如解淀粉芽胞桿菌與死谷芽胞桿菌［22］以及枯草芽胞桿菌［23－24］等。

gyrB基因的分子進化速率大于16SrDNA基因，因而更適合細菌近緣種的準確區分和鑒定，Wang［25］等對8個枯草芽胞桿菌組的個體進行聚類分析時發現，當使用16SrDNA作為靶標分子時，只能將其分為兩個亞群，亞群內16SrDNA的相似度多在98%以上，而gyrB基因序列在亞群中的相似度為75.2%～99.2%，表明gyrB基因可應用于細菌近緣種之間的鑒別［26］。La等在比較4種不同種屬的芽胞桿菌時，同樣發現基于gyrB基因的系統發育樹比基于16SrDNA的系統發育樹更能有效地將他們分開［27］。

抑菌作用測定結果表明：GM－1菌株和無菌發酵液對油菜菌核病菌菌絲細胞結構有明顯的破壞作用，細胞壁變厚、膨大，細胞內原生質分布不均勻，明顯抑制菌絲生長，培養7d的抑菌帶寬度分別達到30mm和16mm，并對菌核的萌發具有明顯的抑制作用，菌液的抑制明顯高于無菌發酵液，其5d的抑制率達100%，無菌發酵液3d的抑制率為90%，但到5d時抑制率僅為4%。這可能是由于GM－1菌株的代謝產物可以推遲菌核的萌發時間，而不能導致菌核的死亡。

室內盆栽試驗表明，GM－1菌株發酵液對油菜種子萌發和生長具有一定的促進作用，對油菜菌核病具有較好的防治效果，表現出良好的生防前景。

有關海洋解淀粉芽胞桿菌對油菜菌核病的抑制作用研究尚未見報道，本研究結果為解淀粉芽胞桿菌用于油菜菌核病的生物防治提供了理論依據，今后將開展GM－1菌株抗菌作用機制、發酵條件優化以及抗菌作用的田間試驗研究。

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