一株橡膠樹白粉病生防菌的鑒定及在橡膠樹葉片定殖規律研究

黃有航， 譚志瓊， 王寅寒， 張榮意

（海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室／海南大學環境與植物保護學院，海口 570228）

橡膠樹白粉病自1918年在爪哇首次報道后，已遍及世界所有植膠園［1］，是橡膠生產上的重要葉部病害，危害橡膠樹新抽葉片，造成大面積落葉，嚴重影響干膠產量［2］。目前對白粉病的防治主要采用化學防治為主，但大量化學藥劑的使用對人畜產生一定的毒害且造成嚴重的環境污染，同時會導致病原菌產生抗藥性。目前國內外將芽胞桿菌作為生防因子來防治白粉病的研究主要集中在小麥白粉病和瓜類作物白粉病。宮宇飛［3］從小麥組織中分離到一株對小麥白粉病有很好防治作用的內生芽胞桿菌E1R－J，1%的粗蛋白提取液對小麥白粉病的抑制率能夠達到86.44%，10%發酵濾液的抑制率能夠達到100%。胡莎［4］等從土壤中分離到芽胞桿菌菌株SN1、SN11，盆栽試驗中治療效果達到83.81%、73.53%，預防效果達到91.72%、87.78%。美國 Agraquest公司［5］將生防菌株枯草芽胞桿菌QST713制成生物農藥，可以用于防治多種植物病害，是一種廣譜生物殺菌劑，其中包括防治小麥白粉病和瓜類作物白粉病。對于橡膠樹白粉病生防菌研究國內外未見報道。

枯草芽胞桿菌［Bacillus subtilis（Ehrenbery）Cohn］對多種植物真菌病害具有很好的拮抗作用，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌，同時可以在植物體內定殖，對人畜無害［6］。芽胞桿菌的生防機制主要是拮抗作用、誘導抗性、競爭作用。對植物病原真菌有顯著抑制活性的主要是非核糖體合成的脂肽類抗生素。伊枯草菌素（iturin）是目前枯草芽胞桿菌拮抗物質中研究較多的抗生素，它是枯草桿菌產生的一大類脂肽類化合物，包括IturinA、B、C、D、E［7－8］。其中IturinA的活性最高，它不僅對真菌有拮抗作用，對部分細菌也有拮抗效果。國外學者從枯草芽胞桿菌KS03菌種中分離到化合物伊枯草菌素A2其分子量大小1042Da［9］。

本研究從膠園土壤中分離到對橡膠樹白粉病有很好抑制作用的拮抗菌株并進行鑒定，同時研究其在橡膠葉片上的定殖規律。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養基

橡膠粉孢（Oidium heveae B.A.Steinm.）采自海南大學環境與植物保護學院教學基地，采回后采用單斑分離法得到純化菌株，并保存在橡膠樹幼苗上。

分離篩選拮抗菌的培養基為NA培養基［10］。

1.2 拮抗菌的分離和篩選

從海南橡膠園取橡膠根際7～10cm土壤樣品，分別稱取5.0g置于50mL無菌水中，在200r／min搖床振蕩10min后靜置，取上清液稀釋成10－2、10－3、10－4，取20μL混合于 NA 培養基倒平板，30℃恒溫培養1d后連續挑取形態完整、差異明顯的單菌落純化后保存。

采用楊意伯［11］等的方法進行孢子萌發試驗和室內盆栽試驗，計算孢子萌發抑制率和防效。同時設置丙環唑（10% 乳油，自研，施藥濃度50μg／mL）作為防效測定的對照。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 拮抗菌的生理生化特性測定

參照文獻的方法［12］，對菌落、菌體、芽胞、鞭毛、氧化酶、硝酸鹽還原、葡萄糖氧化發酵、淀粉水解、37℃生長、43℃生長、明膠液化、5%NaCl生長、7%NaCl生長、葡萄糖產酸、乙酰甲基甲醇（V.P.）、pH5.7生長、檸檬酸鹽、接觸酶、阿拉伯糖產酸、吲哚產生、酪氨酸分解、丙二酸鹽、厭氧生長、甲基紅（M.R.）進行測定。以枯草芽胞桿菌為對照菌［13－14］，同時進行各性狀的測定，以驗證方法的正確性。

1.3.2 拮抗菌株gyrB基因序列測定

根據文獻報道的gyrB 基因引物［15］UP－1s，5′－GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA－3′，引物 UP－2Sr，5′－CGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR反應體系：2×PCR－Mixture 25μL，引物各1μL，總DNA 2μL，ddH2O 21μL，總體積50μL。PCR反應條件：預變性，94℃4min；變性，94℃30s；退火，50℃30min；延伸，72℃45s；30個循環后72℃10 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將所得序列在GenBank數據庫注冊登記，應用ClustalX比對。用軟件DNAMAN V6構建系統發育樹。

1.4 拮抗菌抗利福平標記

參照吳藹民的方法［16］，取20μL拮抗菌株的NB培養液涂在含一定量利福平的NA平板上，28℃培養2～3d挑取單菌落，將得到的新菌株逐級誘導，利福平濃度分別為1、5、10、15、20、50、100、200μg／mL和300μg／mL，直至最后篩選出抗利福平濃度為300μg／mL的突變體菌株。

1.5 抗利福平菌株耐藥穩定性測定

參照吳勝春的方法［17］，將抗利福平菌株在 NA培養基上連續傳代20次后，接種到NB培養基中培養24h，然后涂于含300μg／mL利福平的NA培養基上，觀察其生長情況。

1.6 抗利福平菌株對橡膠樹白粉病的拮抗作用

抗利福平菌株通過孢子萌發試驗和盆栽試驗［11］，計算孢子萌發抑制率和防效。

1.7 抗利福平菌株在橡膠葉片上的定殖

取于30℃條件下培養48h的抗利福平菌株發酵液1mL，用小型噴霧器將菌液噴灑于橡膠樹淡綠葉上，使霧滴均勻地噴灑在葉面，但不形成液滴滴落，每次處理共30片葉；傷葉處理用石英砂處理橡膠淡綠葉表面后再噴灑發酵液；設無菌水為對照，每個處理3個重復，待葉片干燥后置于30℃溫室培養。分別在處理后1、3、5、7、10、15、20d后任取3片葉進行標記菌分離。

將處理后的葉片稱取1g，剪碎研磨后加入10mL無菌水混合振蕩10min，將混合液稀釋至10－3，取其中100μL均勻涂于利福平300μg／mL培養基平板上，30℃恒溫黑暗培養，24h后計數。根據每皿中的菌落數量，計算每克鮮葉片中所含的菌量，計數結果用（cfu／g）來表示。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離

從海南橡膠園取橡膠根際土壤100份，分離到細菌276株，通過初篩和復篩得到拮抗效果穩定的菌株5株。通過孢子萌發試驗，對白粉病孢子萌發抑制率均大于70%，其盆栽試驗防效均達到60%，其中S43的抑制效果最好，孢子萌發抑制率達到86.34%，防效達到86.54%，對白粉病的防效和丙環唑比較無顯著差異，見表1。因此本文選取S43進行進一步研究。

表1 5株拮抗菌對白粉病的拮抗效果1）Table 1 Antagonistic efficacy of five antagonistic bacterial strains to the powdery mildew

2.2 拮抗菌株S43的鑒定

2.2.1 菌體特征和菌落特征

在NA平板上S43菌落白色，圓形，邊緣不整齊，表面有皺紋。菌體呈桿狀，周生鞭毛，革蘭氏染色陽性，產芽胞，芽胞橢圓形、中生、不膨大。

2.2.2 生理生化特性測定結果

拮抗菌株S43的生理生化特征測定結果如表2所示。

表2 S43主要生理生化特征1）Table 2 Main physiological and biochemical features of the strain S43

2.2.3 gyrB基因序列分析

將S43的促旋酶（gyrase）的B亞單位基因序列提交GenBank數據庫，序列大小為1201bp，將得到的序列與芽胞桿菌屬菌株做BLAST比對，發現與其同源性較高的菌株為枯草芽胞桿菌（見圖1）。

圖1 S43系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain S43

綜合形態特征、生理生化特征和gyrB基因序列分析，對照文獻［13－14，18－19］，將該菌株鑒定為枯草芽胞桿菌。

2.3 抗利福平菌株的獲得及耐藥穩定性測定

將抗利福平篩選獲得的菌株在NA平板上培養20代后，用牙簽任意挑取單菌落，接種于含利福平300μg／mL培養基上培養，均能正常生長，說明標記菌株具有很好耐藥穩定性。將利福平誘導獲得的菌株編號為S43＊。

2.4 菌株S43＊對橡膠樹白粉病的拮抗作用

孢子萌發試驗和盆栽試驗表明，S43＊對白粉病孢子萌發抑制率為85.00%，防效為86.12%，拮抗效果基本與原始菌株S43接近。

2.5 菌株S43＊在橡膠葉片上的定殖與消長動態

對橡膠葉片進行傷葉和不傷葉處理均能分離到標記菌株，對照未出現任何細菌菌落，說明標記菌株S43＊能在橡膠葉片上定殖。

兩種處理標記菌株在橡膠葉片的定殖動態如圖2所示，接種后第1天葉片上的標記菌量達到最大，傷葉處理定殖量要比不傷葉處理定殖量大一倍，隨著時間的推移標記菌株的定殖數量持續下降，在接種后第1天到接種后第5天，菌量下降最快，接種10d后，菌量下降速率變慢，接種后15d菌量開始保持穩定。

圖2 傷葉和不傷葉處理標記菌株S43＊在葉片上的定殖動態Fig.2 Colonization dynamics of the marked strain S43＊ on injured and non－injured leaves

3 結論與討論

gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，是編碼DNA負超螺旋的拓撲異構酶—DNA促旋酶的B亞單位蛋白［20］。由于16SrDNA具有高度保守性，且分子量小，包含信息小，對于親緣較近的菌屬，分辨率不高。gyrB基因存在于大多數細菌中，且不會發生頻繁的水平轉移，在不同的蛋白及蛋白的不同位點，其氨基酸替代率也不相同。因此gyrB基因可以應用于細菌的系統發育學，特別是在近緣種區分及鑒定。

本試驗從橡膠根際土壤中篩選到一株對橡膠白粉病有較好拮抗作用的菌株S43，根據形態特征、生理生化特征并結合gyrB基因序列比對，將S43菌株鑒定為枯草芽胞桿菌。

作為生防菌株，應該選擇定殖速度快、定殖量大、營養需求低、存活能力強、存活時間久的有益微生物。生防菌株在植物體內定殖是一個復雜的過程，受諸多因素的影響。除了菌株本身原因外，植物組織結構、外部環境的不同都對定殖產生影響。對定殖規律的深入研究，揭示定殖過程中諸多影響因子，有助于生防菌更好地應用于農業生產上［21］。

本試驗對標記菌株S43＊進行定殖規律研究，研究表明，標記菌株S43＊能在橡膠葉片上較好地定殖。在接種后第1天，菌量達到最大，但隨著時間的推移，菌量逐漸減少，接種15d后，菌量基本保持穩定。傷葉接種和不傷葉接種10d以后葉片標記菌量相差不多。其中傷葉處理在接種初期葉片標記菌的定殖量要高于不傷葉處理，但隨著時間推移，兩種處理葉片上最終定殖菌量相差不多。自然定殖的芽胞桿菌的數量，涉及橡膠葉片上微生態學的研究，不是本論文的研究重點，我們的拮抗芽胞桿菌含有利福平抗性標記，自然定居的芽胞桿菌不影響本研究的結果。

寄主表面存在傷口，傷口成為細菌入侵的通道，傷口滲出物成為細菌生存的營養物質，從而促進細菌的定殖，故傷葉處理比不傷葉處理定殖率要高。但是由于寄主本身生理學性狀會決定其內部環境中生存的種群數量大小，且侵入細菌會與植物內部已定殖的其他微生物之間存在競爭、拮抗、互利等諸多關系，最終會導致植物體內菌群數量趨于穩定。

本研究所采用的分離標記菌株的方法，只能分離耐藥性的菌株，并不能證明兩株標記菌株是橡膠葉片上的內生細菌。對于這兩株是否可以作為內生細菌，需進一步研究。

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