甘薯病毒病害（SPVD）的多重RT－PCR檢測方法及其應用

張 盼， 蘭新芝， 喬 奇， 張德勝，秦艷紅， 田雨婷， 王 爽， 張振臣＊

（1.河南省農業科學院植物保護研究所，鄭州 450002；2.河南省農作物病蟲害防治重點實驗室，鄭州 450002；3.河南省新縣農業局植保站，新縣 465500）

甘 薯 病 毒 病 害 （sweet potato virus diseases，SPVD）是由甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）協生共侵染甘薯引起的病毒病害［1］。感染SPVD的甘薯表現植株矮化，葉片褪綠、畸形等癥狀。SPVD對甘薯產量影響極大，嚴重時可造成90%以上的產量損失，甚至絕收，是甘薯上的毀滅性病害［2－3］。張振臣等［4］利用血清學、分子生物學和嫁接傳染試驗等方法首先發現了SPVD在我國的發生，目前主要分布在廣東、江蘇、四川、安徽和福建等地。為了加強對SPVD的預警和控制，防止該病的進一步蔓延危害，有必要建立快速、高效的檢測技術。

用于甘薯病毒檢測的常用方法是酶聯免疫吸附技術（ELISA）和PCR技術，ELISA檢測技術耗時長、靈敏度較低，而且需要分別檢測SPCSV和SPFMV才能確定SPVD是否存在。另外，SPCSV在中國存在2個株系（EA和 WA），SPFMV存在4個株系（O、RC、EA和C），其中 O、RC和EA 3個株系的關系相對較近，將它們歸為一類，稱之為SPFMV CH 株系類型（SPFMV－CH）；C株系與其他3個株系的關系較遠，稱之為SPFMV CH2株系類型（SPFMV－CH2）。目前已有人建議將C株系劃分為一個新種［5］。由于SPCSV與SPFMV不同株系的互作可能引起不同的產量損失［6］，目前利用ELISA方法還不能有效區分SPFMV的不同株系。而利用單一的RT－PCR進行檢測時，需要進行多次PCR反應，工作量大，效率低。多重RT－PCR技術是近年發展起來的一種可用于多種病原體檢測的技術，具有特異性強、靈敏性高的特點，能在較短時間內同時完成多種病原的檢測，尤其適合于甘薯上一些容易混淆又常常混合侵染的病毒的檢測［6－7］。本研究建立了在一次PCR反應中即可檢測SPVD是否存在的方法，并且該方法可有效區分SPFMV的兩個株系類型，可為SPVD的快速檢測以及對該病的監測預警提供技術手段。

1 材料和方法

1.1 病毒材料及質粒

分別在廣東惠州、四川南充、江蘇徐州等地采集具有典型SPVD癥狀的甘薯莖蔓栽種于防蟲溫室中，分別利用血清學方法和普通RT－PCR方法檢測SPCSV和SPFMV，以確定感染SPVD的甘薯植株，并通過測定SPFMV外殼蛋白（CP）基因的核苷酸序列來確定SPFMV的株系類型，最后選定若干個SPVD感病植株備用。含SPFMV－CH、SPFMVCH2、甘 薯 潛 隱 病 毒 （Sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯脈花葉病毒（Sweet potato vein mosaic virus，SPVMV）CP 基因以及SPCSV Hsp70基因的重組質粒由本實驗室構建并保存［8－9］。將經過NCM－ELISA和 RT－PCR檢測SPCSV 和SPFMV為陰性的甘薯脫毒試管苗作為陰性對照。從洛陽農林科學院試驗田分別采集感染SPVD的甘薯葉片和薯塊用于所建立的多重RT－PCR方法的驗證。

1.2 酶及試劑（盒）

UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒為上海生工生物工程公司產品；UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術公司；RNase抑制劑、AMV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶、pMD19－T載體、T7RNA Polymerase購自TaKaRa公司。其他常用試劑為國產分析純。

1.3 引物的設計與合成

根據NCBI GenBank中登錄的SPCSV Hsp70基因和SPFMVCP基因的核苷酸序列設計了4對特異性引物（表1），引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 多重RT－PCR擴增的特異性引物Table 1 Specific primers for multiplex RT－PCR amplification

1.4 核酸提取

利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式總RNA抽提試劑盒提取感病甘薯葉片的總RNA。甘薯薯塊總RNA的提取參照楊元軍等［10］方法進行。

1.5 單一RT－PCR

以提取的感病甘薯葉片總RNA為模板，反轉錄反應體系為10μL，包括2μL 5×RT buffer，1μL MgCl2（25mmol／L），1 μL dNTP 混 合 物 （各10mmol／L），0.5μL CSV2引物或0.5μL FMV 2引物，0.25μL RNase抑制劑（40U／μL），0.5μL反轉錄 酶 （AMV Reverse Transcriptase）（5U／μL），4.25μL樣品RNA，DEPC－H2O 0.5μL。反應程序為：42℃反轉錄40min，99℃5min，5℃5min。

PCR反應體系為25μL，包括2.5μL 10×PCR buffer（Mg2＋－），0.2μL Taq 酶（5U／μL），0.5μL上游引物（CSV 1、FMV 1、FMVCH 或 FMVCH2）（10 μmol／L），0.5μL下游引物（CSV 2或 FMV 2）（10 μmol／L），1μL dNTP混合物（各10mmol／L），1μL MgCl2（25mmol／L）；以2μL反轉錄產物為模板，用dd H2O補足至25μL。反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳、UVP凝膠成像系統觀察和照相。

1.6 多重RT－PCR反應條件的篩選

以單一RT－PCR反應體系為基礎，對影響多重RT－PCR的主要反應條件進行優化，在優化某一條件時，其他條件不變。退火溫度分別設50.0、51.9、53.7、55.3、57.6 ℃和60.0 ℃ 6個處理；dNTP 混合物（各2.5mmol／L）分別設0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL 6個處理；MgCl2濃度（25mmol／L）分別設0、0.5、1、1.5、2、2.5μL 6個處理，Taq 酶（5U／μL）分別設0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL 6個處理；引物濃度（10μmol／L）設4個處理，引物FMV1∶FMVCH∶FMVCH2∶FMV2∶CSV1∶CSV2的加入量分別為（1）0.2μL∶0.2μL∶0.4μL∶0.8μL∶0.4μL∶0.4μL；（2）0.2μL∶0.4μL∶0.4μL∶1.0μL∶0.4μL∶0.4μL；（3）0.2μL∶0.4μL∶0.6μL∶1.2μL∶0.6μL∶0.6μL；（4）0.2μL∶0.3μL∶0.5μL∶1.3μL∶0.5μL∶0.5μL。

1.7 多重RT－PCR的特異性試驗

1.7.1 幾種甘薯病毒RNA體外轉錄產物的制備

按照T7RNA Polymerase說明書進行RNA體外轉錄。在上游引物的5′端引入T7啟動子序列，分別以SPFMV－CH、SPFMV－CH2、SPLV、SPVMV的CP基因和SPCSV Hsp70基因的重組質粒為模板，進行PCR擴增，擴增的雙鏈DNA片段在T7 RNA聚合酶的作用下經體外轉錄形成單鏈RNA（cRNA），純化后用核酸測定儀測定cRNA濃度，根據阿伏伽德羅常數將濃度換算為拷貝數。

1.7.2 多重RT－PCR的特異性試驗

利用甘薯上常見的兩種Potyvirus病毒SPLV和SPVMV測試特異性。分別以濃度為106拷貝／μL的 SPCSV、SPFMV－CH、SPFMV－CH2、SPLV、SPVMV的體外轉錄RNA為核酸模板，進行多重RT－PCR擴增，檢測多重RT－PCR的特異性。

1.8 多重RT－PCR的靈敏性試驗

分別將SPCSV、SPFMV－CH、SPFMV－CH2的體外轉錄RNA，進行10倍梯度稀釋，分別取濃度為108～101拷貝／μL的8個濃度梯度的RNA作為核酸模板，進行多重RT－PCR擴增，以檢測其靈敏性。

1.9 多重RT－PCR產物的克隆和序列測定

將純化后的多重RT－PCR產物分別與pMD19－T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌TG1，經藍白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成。利用DNAMAN和BLAST對所測序列進行比較分析［9］。

1.10 多重RT－PCR的初步應用

從田間分別采集了10份感染SPVD的甘薯葉片樣品和7份薯塊樣品，按照1.4中的方法提取總RNA，利用建立的多重RT－PCR方法對樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 多重RT－PCR反應條件的篩選

試驗結果表明，退火溫度在50～55.3℃之間的擴增效果都比較好；dNTPs加入量在1μL以上時均能很好地擴增出全部目的條帶；當Mg2＋加入量達到0.5μL時就能夠擴增出全部目的條帶，并且隨濃度的增加條帶越來越亮，但當 Mg2＋加入量為2.5μL時，各目的條帶的亮度反而變弱；Taq DNA聚合酶加入量為0.2μL時，能清晰地擴增出全部目的條帶，隨著酶量的增加，沒有很大的變化；4種引物濃度組合的擴增效果都比較好，不同組合對擴增效果影響不大（圖略）。

根據不同條件對試驗結果的影響，綜合考慮擴增效果和試驗成本，最終優化的多重RT－PCR反應體系為：多重RT反應體系為10μL：2μL 5×RT buffer，1μL MgCl2（25mmol／L），1μL dNTP 混合物（各10mmol／L），0.5μL CSV2引物，0.5μL FMV2引物，0.25μL RNase抑制劑（40U／μL），0.5μL 反 轉錄酶 （AMV Reverse Transcriptase）（5U／μL），4.25μL樣品 RNA。反應程序為：42℃反轉錄40min，99℃5min，5℃5min。多重PCR反應體系為25μL：2.5μL 10×PCR buffer（Mg2＋－），0.3μL Taq 酶（5U／μL），1.5μL dNTP Mixture（各2.5mmol／L），1.5μL MgCl2（25mmol／L），0.5μL引物CSV1，0.5μL引物CSV2，0.2μL引物FMV1，1.3μL引物FMV2，0.3μL引物FMVCH，0.5μL引物FMVCH2，2μL反轉錄產物，ddH2O補足25μL。反應程序為：94℃ 預變性3min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環；最后72℃ 延伸10min。

2.2 多重 RT－PCR與單一 RT－PCR擴增效果的比較

以同時感染SPCSV以及SPFMV 2個株系類型的SPVD甘薯植株葉片總RNA為模板，利用建立的多重RT－PCR反應體系對樣品進行擴增，結果表明，多重RT－PCR擴增結果與單一RT－PCR的擴增結果一致（圖1）。

圖1 多重和單一RT－PCR檢測結果比較Fig.1 Comparison of the test results between multiplex RT－PCR and single RT－PCR

2.3 多重RT－PCR的特異性分析

體外轉錄的RNA經純化后測定RNA的濃度，各目的cRNA的濃度與拷貝數見表2。利用建立的多重RT－PCR方法對濃度為106拷貝／μL的SPFMVCH2、SPFMV－CH、SPCSV、SPLV和SPVMV幾種病毒的cRNA進行擴增。結果顯示，從SPFMV－CH、SPFMV－CH2和SPCSV的cRNA以及兩兩混合的cRNA和3種混合的cRNA中均能擴增出相應的目的條帶，而從SPLV和SPVMV中均未擴增出條帶。說明建立的多重RT－PCR特異性較好（圖2）。

表2 各目的基因體外轉錄合成RNA的濃度與拷貝數Table 2 Concentrations and copies of RNA synthesized from the objective gene in vitro

圖2 多重RT－PCR的特異性檢測Fig.2 Specific detection by multiplex RT－PCR

2.4 多重RT－PCR的靈敏性分析

靈敏性試驗結果表明，建立的多重RT－PCR方法對SPFMV－CH2、SPFMV－CH 和SPCSV 的最低檢測濃度分別為1.42×104拷貝／μL、1.32×104拷貝／μL和2.47×104拷貝／μL（圖3）。說明該方法可實現對2種甘薯病毒RNA104拷貝水平的檢測。

2.5 多重RT－PCR擴增產物的鑒定

為了進一步驗證多重RT－PCR擴增出的片段為目的病毒的核酸序列，對部分多重RT－PCR的擴增產物進行了克隆和序列測定。結果表明，所擴增出的4個片段的核苷酸序列與GenBank中SPFMV和SPCSV核苷酸序列的一致性最高分別達92%、96%、98%和97%左右，說明擴增出的片段均為目的病毒的特異性片段。

圖3 多重RT－PCR的靈敏性Fig.3 Sensitivity of multiplex RT－PCR assay

2.6 多重RT－PCR檢測方法的初步應用

分別對10份感染SPVD的甘薯葉片樣品和7份薯塊樣品進行了檢測，結果表明，本研究所建立的多重RT－PCR方法能從葉片和薯塊中檢測出SPVD的兩種病原，并且能夠區分SPFMV的兩個主要株系類型。例如，對甘薯葉片的檢測中，樣品1含有SPFMV－CH株系和SPCSV 2種病毒，樣品6含有SPFMV－CH、SPFMV－CH2和SPCSV 3種病毒；對甘薯薯塊的檢測中，樣品2含有SPFMV－CH株系和SPCSV 2種病毒，樣品6含有SPFMV－CH2株系和SPCSV 2種病毒（圖4、圖5）。

3 結論與討論

本文設計了針對SPFMV和SPCSV所有株系的通用引物，同時還設計了能區分SPFMV 2個主要株系類型（CH和CH2）的特異性引物。通過優化反應條件，初步建立了在一次PCR反應中即可檢測SPVD是否存在的方法，該方法可用于甘薯植株和薯塊中病毒的檢測。SPVD是甘薯上的毀滅性病害，建立SPVD快速高效的檢測技術，對于該病的預警和控制具有重要意義。

影響多重RT－PCR擴增效果的因素很多。例如，擴增的目的片段應盡量選擇小片段，各片段大小的差距要適中，以減小擴增效率不均衡對擴增效果的影響［11］。本研究設計的擴增片段均小于600bp，有效減小了擴增效率不均衡的影響。在引物設計方面，不同引物之間互補的堿基不能太多，避免引物之間形成二聚體等。Tm值相近的引物更有利于多重RT－PCR擴增［12］。另外，在一個PCR反應體系中同時加入多個引物，引物之間的競爭也會影響擴增效果。由于當SPCSV和SPFMV共同侵染甘薯時，SPCSV的含量變化不明顯，而SPFMV的含量會比其單獨侵染時增加600倍［13］，因此本研究適當提高了SPCSV引物的濃度，達到了比較好的擴增效果。

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