逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測南芥菜花葉病毒

郭立新， 譚 毅， 劉永豐， 鄧叢良， 段維軍， 許鄒亮

（1.北侖出入境檢驗檢疫局，寧波 315800；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 101312；3.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012；4.北京藍譜生物科技有限公司，北京 100086）

南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）是豇豆花葉病毒科（Comoviridae）線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）成員。其寄主范圍廣泛，可侵染174屬215種植物，引起最常見癥狀是葉片斑駁和脫落、植株矮化、嚴重畸形、耳突［1］。ArMV主要經(jīng)汁液摩擦和介體線蟲傳播，傳播介體主要為異尾劍線蟲（Xiphinema diversicaudatum），ArMV 也可通過種子、鱗球莖、塊莖和苗木等無性繁殖材料遠距離傳播［1－2］。該病毒主要分布在荷蘭、比利時等歐洲國家和美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、南非、日本，我國尚未有報道［1，3］。

目前，ArMV的檢測主要采用生物學［4］、電子顯微鏡［4］、血清學［1，5－6］、RT－PCR［1－2，5－6］、實時熒光 RTPCR方法［1，7］，而未見有環(huán)介導等溫擴增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技術檢測的報道。LAMP技術是Notomi等［8］2000年首先提出來的一種新的核酸擴增技術，該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一個具有鏈置換特性的 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在等溫條件下高效擴增靶基因，靈敏度和特異性高［8］。該方 法 已 應 用 于 病 毒［9－12］、類 病 毒［13］、細 菌［14］、真菌［15］及轉基因［16］的檢測。本研究根據(jù)南芥菜花葉病毒外殼蛋白基因序列設計特異性引物，成功建立了ArMV的RT－LAMP檢測體系，用于ArMV的快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

1份南芥菜花葉病毒陽性質控物，購自美國Agdia公司，簡寫為Ar－A；另1份南芥菜花葉病毒陽性質控物，購自德國DSMZ公司，簡寫為Ar－D；1份受ArMV侵染的唐菖蒲葉片，由北京出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室提供，簡寫為YP。3種可侵染大豆的病毒，即：番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）及南方菜豆花葉病毒（Southern bean mosaic virus，SBMV）陽性質控物，均購自美國Agdia公司。1份感染菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）的美國進境大豆種子，由寧波出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室提供。以上陽性質控物樣品狀態(tài)均為新鮮葉片經(jīng)液氮處理，磨成粉末狀。

1.1.2 分子生物學試劑

RNeasy Plant Mini Kit購自 Qiagen公司，TaKa－Ra One Step RNA PCR Kit（AMV）購自大連寶生物公司，F(xiàn)luorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit 購 自 EIKEN CHEMICAL CO.，LTD.。RT－LAMP引物及 RT－PCR引物［2］由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 主要儀器

LA－320C實時濁度儀。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取

分別對樣品及健康大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］葉片，使用 RNeasy Plant Mini Kit進行植物總RNA提取，具體操作見試劑盒說明書。用核酸蛋白質分析儀測A260及A280，計算核酸的濃度和純度。

1.3.2 RT－LAMP引物的設計和合成

從GenBank調出所有南芥菜花葉病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6.0.40軟件進行比對分析，找出ArMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設計軟件PrimerExplorer V4（http：∥primerexplorer.jp／elamp4.0.0／index.html）設計了5組引物，其中有2組不滿足引物設計原則，再次通過對引物區(qū)段各分離物進行同源性比對，選擇合成了其中2組（表1）。

表1 南芥菜花葉病毒RT－LAMP檢測引物Table 1 Primers used in the detection of Arabismosaicvirusby RT－LAMP

1.3.3 RT－LAMP引物的篩選

以Ar－D、YP、Ar－A總RNA為模板，健康大豆葉片總RNA為陰性對照，水為空白對照，利用各組引物進行RT－LAMP檢測，即在25μL反應體系中加入2μL Ar－FIP （20μmol／L），2μL Ar－BIP （20μmol／L），0.25μL Ar－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，2.5μL RNA，無 RNA酶的dH2O補至25μL。反應條件為：60℃60min。

1.3.4 RT－LAMP引物特異性檢測

以ToRSV、TRSV、SBMV、BPMV 和 Ar－A 總RNA為模板，按1.3.3體系和條件進行RT－LAMP反應。

1.3.5 靈敏度對比試驗

以Ar－D總 RNA 為模板，用 無 RNA 酶的dH2O稀釋總RNA進行相對靈敏度檢測，在25μL反應體系中，總 RNA分別為20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg，進行實時 RT－LAMP反應。同時對稀釋的RNA按試劑盒說明書進行普通RTPCR檢測，即在25μL反應體系中加入2.5μL 10×One Step RNA PCR Buffer，5μL MgCl2（25mmol／L），2.5μL dNTP Mixture （各 10mmol／L），0.5μL RNase Inhibitor（40U／μL），0.5μL AMV RTase XL（5 U／μL），0.5 μL AMV－Optimized Taq （5U／μL），0.5μL引物ArMV1［2］（20μmol／L）（5′－TGCATATAT GCAGCCCTTGTACTTA－3′），0.5μL引物 ArMV2［2］（20μmol／L）（5′－CGATGTAACACCCGGGGTATT －3′），2.5μL RNA，無 RNA酶的dH2O補至25μL。反應條件為：50℃30min，94℃2min；然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.6 ArMV的RT－LAMP目視檢測

以Ar－D、YP、Ar－A總RNA為模板，健康大豆葉片總RNA為陰性對照，水為空白對照，進行RTLAMP目視熒光檢測，即在25μL反應體系中加入2μL Ar2－FIP（20μmol／L），2μL Ar2－BIP（20μmol／L），0.25μL Ar2－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar2－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，1LFluorescent Detection Reagent，2.5μL RNA，無RNA酶的dH2O補至25μL。反應條件為：60℃70min，95℃2min。

2 結果與分析

2.1 RT－LAMP引物的篩選

本研究所合成的2組引物，其中Ar2組引物僅能檢出Ar－D、Ar－A分離物，Ar4組引物能檢出 Ar－D、YP和Ar－A三個分離物（圖1），故最終選擇了Ar4組引物作為ArMV RT－LAMP檢測的最佳引物（圖2）。

圖1 RT－LAMP檢測最佳引物的篩選Fig.1 Screening of the optimal primers for RT－LAMP

2.2 RT－LAMP引物特異性檢測

如圖3所示，Ar4組引物有較強的特異性，5種大豆病毒中僅能檢出ArMV，不能檢出ToRSV、TRSV、SBMV和BPMV，與預期結果相符。

2.3 靈敏度對比試驗

靈敏度試驗結果顯示，本試驗所建立的RTLAMP檢測方法最小檢測限為20pg（圖4），與RTPCR檢測結果一致（圖5）。

2.4 ArMV的RT－LAMP目視檢測

RT－LAMP擴增結束后，在正常光照條件下，肉眼可觀察到Ar－D、YP和Ar－A三個陽性分離物反應管顏色明顯變?yōu)辄S綠色，而空白對照與陰性對照反應管顏色沒有改變（圖6）。

3 討論

目前，在LAMP反應不開蓋的前提下，其結果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和濁度儀對LAMP反應進行實時監(jiān)控這三種方法。目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀而使反應液呈現(xiàn)渾濁，但是當渾濁度較低時，肉眼很難察覺。利用實時濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結果，但是需要使用特定的儀器設備，在試驗研究階段比較合適。目視檢查染料顏色變化主要依據(jù)反應前體系中加入鈣黃綠素來實現(xiàn)，鈣黃綠素是一種螯合劑，反應前與試劑中的錳離子結合處于淬滅狀態(tài)，擴增反應的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光，通過觀察熒光的有無可判斷是否有擴增［17］。比色分析既提高了肉眼的識別率，又可直接用于現(xiàn)場診斷，是最為簡單方便的LAMP結果判定方式，適用于成熟方法的推廣應用。本研究利用實時濁度儀對ArMV RTLAMP檢測方法的引物進行了優(yōu)選并進行了特異性及靈敏度等試驗，成功建立了南芥菜花葉病毒的RT－LAMP檢測方法，并在反應前向反應液中加入鈣黃綠素，陰陽性結果顏色差別明顯，易于現(xiàn)場判斷。

本研究建立的ArMV實時濁度RT－LAMP檢測方法與以往檢測ArMV的方法相比，具有如下優(yōu)點［8，13］：1、操作簡單。RT－LAMP在60～65 ℃恒溫條件下進行，不需要復雜儀器設備，只需維持恒溫的水浴鍋或金屬浴就可完成。且可通過在反應液中加入鈣黃綠素，反應結束后裸眼觀察顏色變化，判定結果，不需電泳儀和紫外觀測。2、特異性高。該技術通過4條引物識別靶基因6段不同的序列，在很大程度上提高了檢測的特異性。3、高效靈敏。該技術在恒溫條件下進行，不需通過溫度循環(huán)實現(xiàn)基因擴增，且反轉錄可與PCR一步進行，節(jié)約了時間。60min內DNA能擴增到109～1010倍。其靈敏度與PCR相當。因此，RT－LAMP技術檢測ArMV適合基層應用，有很好的應用前景。

［1］ 廖富榮，于翠，張永江，等.GB／T 28073－2011南芥菜花葉病毒檢疫鑒定方法［S］.中華人民共和國國家標準，2011.

［2］ 于翠，楊翠云，張舒亞，等.南芥菜花葉病毒的幾種PCR檢測方法的建立和比較研究［J］.植物病理學報，2008，38（4）：388－393.

［3］ 馬新穎，汪琳，任魯風，等.從荷蘭進口植物中檢出南芥菜花葉病毒［J］.植物保護學報，2007，34（2）：217－218.

［4］ 吳際云，陳枝楠，鄧瓊，等.SN／T 1150－2002 植物檢疫 南芥菜花葉病毒檢疫鑒定方法［S］.中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準，2002.

［5］ 丁元明，秦紹釗，王云月，等.進境唐菖蒲種球攜帶南芥菜花葉病毒的檢測［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2008，27（1）：46－48.

［6］ 高崇省，郭京澤，劉鵬，等.郁金香種球傳帶南芥菜花葉病毒的檢測［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2007，16（1）：98－99.

［7］ 鄧叢良，呂玉峰，梁新苗，等.應用 RT－Realtime PCR檢測南芥菜花葉病毒［J］.植物檢疫，2008，22（2）：80－82.

［8］ Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.

［9］ Lee M S，Yang M J，Hseu Y C，et al.One－step reverse transcription loop－mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Cymbidium mosaic virus［J］.Journal of Virological Methods，2011，173：43－48.

［10］Zhao K，Liu Y，Wang X F，et al.Reverse transcription loopmediated isothermal amplification of DNA for detection of Barley yellow dwarf viruses in China［J］.Journal of Virological Methods，2010，169（1）：211－214.

［11］Liu Y H，Wang Z D，Qian Y M，et al.Rapid detection of Tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop－mediated isothermal amplification method［J］.Archives of Virology，2010，155：1681－1685.

［12］Kuan C P，Wu M T，Lu Y L，et al.Rapid detection of squash leaf curl virus by loop－mediated isothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2010，169：61－65.

［13］Boubourakas I N，F(xiàn)ukuta S，Kyriakopoulou P E.Sensitive and rapid detection of peach latent mosaic viroid by the reverse transcription loop－mediated isothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2009，160：63－68.

［14］Yan M Q，Yong C G，Xian E Z，et al.Loop－mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis spores［J］.Biotechnology Letters，2007，29（12）：1939－1946.

［15］Hayashia N，Arai R，Tada S，et al.Detection and identification of Brettanomyces／Dekkerasp.yeasts with a loop－mediated isothermal amplification method［J］.Food Microbiology，2007，24：778－785.

［16］袁瑛娜，單瀟瀟，王宗德，等.應用LAMP實時濁度法檢測轉基因大豆［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（10）：1264－1267.

［17］Norihiro T，Yasuyoshi M，Hidetoshi K，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products［J］.Nature Protocols，2008，3（5）：877－882.