葡萄潰瘍病菌轉化子致病力快速評價體系的建立

劉愛芬， 張 鑫， 張 瑋， 燕繼曄，劉瑞琪， 龐倩茹， 李興紅， 黃金光＊

（1.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；2.山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109；3.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097；4.河北農業大學生命科學學院，保定 071001）

葡萄是世界上重要的經濟果樹之一，據國家葡萄產業體系統計，隨著葡萄所創造的經濟效益的增加，截至2010年底我國葡萄種植面積已增至53萬hm2。長期以來，葡萄病害是影響葡萄產業發展的重要因素，近幾年研究發現葡萄潰瘍病在我國葡萄主產區造成了嚴重危害，且有加重趨勢。葡萄潰瘍病主要由葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌引起，病原菌侵染后可導致維管束變褐，進而使枝干或主干壞死，嚴重時會造成整株死亡［1］。目前，葡萄潰瘍病已在美國、法國、西班牙等17個國家發現［2］，在不同國家均造成了一定程度的危害。據統計，由葡萄潰瘍病在美國加利福尼亞州造成的危害僅2001年就損失2.6億美元，約占加州地區葡萄總產值的10%［3］。在我國，李興紅研究組2009年首次報道了Botryosphaeria dothidea［4］和B.rhodina［1］引起的葡萄潰瘍病。目前，該病害在山東、廣西、遼寧、湖北、湖南、四川、甘肅、河南等葡萄主產區均已有發現。

目前，關于葡萄潰瘍病的報道集中于病原菌的鑒定和種群結構方面，對病原菌致病機理的研究尚未見報道［2］。隨著分子生物學和分子遺傳學技術的發展，人們開始用分子生物學的方法去獲得插入轉化子，為挖掘病菌的致病基因進而明確其致病機理做準備。然而對于一個龐大的轉化子庫，能否快速、準確地篩選出致病力突變體尤為重要。有關葡萄座腔菌科真菌致病力的室內評價方法，通常是通過接種離體的綠枝條，Brown－Rytlewski和 McManus已成功運用綠枝條接種方法比較了B.dothidea和B.obtusa的致病力強弱［5］，Urbez－Torres 通過接種葡萄綠枝條將葡萄座腔菌科9個種的致病力分為高、中、低3個等級［6］。但是利用綠枝條對轉化子庫進行篩選會遇到很多限制因素。如：葡萄綠枝條生長受季節的影響，并且同時采集大量同一品種的粗細、木質化程度等較為一致的葡萄綠枝條非常困難，致使轉化子庫的評價工作會受到季節的影響。為了建立一個快速高效的葡萄潰瘍病菌轉化子致病力評價體系，本研究從REMI轉化子庫中隨機挑選50株轉化子，探討了以‘富士’蘋果果實為接種替代物，3種接種方法、4個不同菌齡對葡萄潰瘍病菌致病力的影響，并與野生型菌株CSS－01s的致病力進行比較，同時采用了接種葡萄綠枝條的方法［7］對評價結果進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：野生型葡萄潰瘍病菌（B.rhodina）菌株CSS－01s，由本實驗室保存；50株葡萄潰瘍病菌REMI轉化子，由本實驗室轉化子庫中隨機選取。

供試接種材料：直徑為（20±5）cm的煙臺‘富士’蘋果果實（一級果），購于超市發超市，一年生‘夏黑’葡萄綠枝條由北京市農林科學院林業果樹研究所提供。

1.2 在蘋果果實上的接種

1.2.1 不同接種方法對致病力測定的影響

分別用無傷、昆蟲針針刺（1、4、8針）、5mm 的打孔器去掉果皮5種方法處理同一蘋果。將直徑為4mm的CSS－01s菌餅接種到相應的處理處，重復6次。將接種后的蘋果放入保鮮盒中28℃保濕培養，每12h觀察并測量病斑大小。

1.2.2 不同菌齡對致病力測定的影響

將菌齡為1、2、3、4d的野生型菌株和隨機挑選的5個轉化子采用打孔器法接種蘋果，每個果實7處傷口，分別將直徑為4mm的菌餅和無菌培養基接種到同一果實上，每個菌齡重復5次，并將其放于28℃培養箱中保濕培養，每12h記錄其發病狀況。

1.2.3 不同轉化子的致病力測定

分別將隨機挑選的50株轉化子、野生型菌株CSS－01s的4mm菌餅接種到用打孔器處理過的傷口上，在同一個蘋果最大緯線上均勻分布4處傷口，分別將2個轉化子及野生型菌餅和無菌培養基接種到相應的傷口上，每個處理3次重復，將其放于28℃培養箱中保濕培養，3d后測量并記錄病斑大小。

1.3 在葡萄綠枝條上不同轉化子的致病力測定

參考 Urbez－Torres［6］等和燕繼曄［7］等測定葡萄潰瘍病菌（B.dothidea）致病力的方法，將在蘋果上做過篩選的50株轉化子和野生型CSS－01s接種一年生葡萄綠枝條（‘夏黑’），每個處理重復5次，5d后觀察并測量接種結果。

1.4 數據分析

所得數據均采用SAS 9.1數據分析軟件處理。不同菌齡處理間致病力的顯著性差異采用LSD法，轉化子在兩種不同寄主植物上致病力的顯著性差異采用Duncan氏新復極差法。檢驗水平均為P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 在蘋果果實上不同接種方法對菌株發病速度的影響

不同接種方法對野生型菌株CSS－01s在蘋果果實上是否發病及發病快慢均有影響。無傷接種不能引起‘富士’蘋果果實發病，針刺和打孔法均能使蘋果果實在接種點處出現水漬狀棕黃色病斑。在接種12h后，用打孔器打孔接種的6個蘋果果實均出現癥狀，但用針刺接種的6個蘋果果實在接種29h后才表現癥狀。在接種36h后，用打孔器打孔法接種的蘋果果實病斑直徑為4.33cm，而用針刺1針接種的蘋果果實病斑直徑為2.74cm，針刺4針和8針的蘋果果實病斑直徑分別為2.92cm和3.04cm。在接種46h后，蘋果果實上不同處理間的病斑大小已無法區分。用打孔器打孔的方法比用針刺接種發病快，且一致性高，因此用打孔器的方法便可縮短測量時間，加快篩選進度（圖1）。

圖1 不同接種方法接種野生型菌株CSS－01s 2d后在蘋果果實上的病斑直徑Fig.1 Lesion diameter on apple fruit at 2days after inoculation with wild type strain CSS－01sby different methods

2.2 在蘋果果實上不同菌齡對轉化子致病力的影響

在蘋果果實上，接種16h后，菌齡為1、2、3d的野生型菌株和轉化子均出現棕黃色病斑，菌齡為4d的CSS－01s也出現棕黃色病斑，然而5個轉化子均未出現棕黃色病斑，接種64h后，5個不同菌齡的轉化子和CSS－01s均使蘋果果實發病。其中菌齡為1、2、3、4d的CSS－01s在蘋果果實上的病斑直徑分別為1.60、0.87、1.0cm 和0.56cm，所以隨著菌齡的增加，病原菌侵染蘋果果實并使其產生病斑的時間相應延長。但是通過比較菌齡為1d的5個轉化子和CSS－01s的病斑直徑可以看出和CSS－01s具有極顯著差異的轉化子為k31、k32、k34、k37，而通過比較菌齡為2、3、4d的評價結果可以發現，和CSS－01s具有極顯著差異的轉化子均為k32、k37。所以菌齡會影響菌株的發病快慢，原因可能是菌齡與菌絲的活力等有關。如圖2，菌齡為1d的CSS－01s菌落顏色為白色，氣生菌絲稀疏，剛長滿培養皿。而菌齡為2、3、4d的CSS－01s菌落顏色逐漸由白色變為褐色，氣生菌絲越來越致密。通過比較4個菌齡的篩選結果，發現菌齡為2d的接種結果已經穩定（圖3）。

圖2 不同菌齡的CSS－01s在PDA上菌落形態Fig.2 Colony morphology of CSS－01swith different cell age on PDA plate

圖3 不同菌齡的轉化子與野生型接種2d后在蘋果果實上的病斑直徑Fig.3 Lesion diameter on apple fruit at 2days after inoculation with wild type strain CSS－01s and the transformants with different cell ages

2.3 在蘋果果實和葡萄綠枝條上致病力結果的比較

通過比較50株REMI轉化子與野生型菌株CSS－01s在蘋果果實上的病斑大小發現，CSS－01s在‘富士’蘋果果實上的病斑直徑為5.58cm，有13株轉化子與CSS－01s致病力沒有顯著差異，而有37株比CSS－01s的致病力減弱。參照燕繼曄［7］等綠枝條接種的方法將50株轉化子和CSS－01s接種葡萄綠枝條，通過比較轉化子和CSS－01s在葡萄綠枝條上的病斑長度，發現CSS－01s接種的病斑長度為7.0cm，比其致病力增強的轉化子有21株，致病力減弱的有26株，沒有顯著差異有3株。通過比較50株轉化子在這兩種寄主上的篩選結果發現，用葡萄綠枝條篩選的致病力減弱的轉化子有25株與在蘋果上的篩選結果一致。由此可見，在葡萄綠枝條上致病力減弱的轉化子有96.15%在‘富士’蘋果果實上致病力也是減弱的，但是致病力增強的轉化子在蘋果果實上卻沒有篩選到。

表1 隨機選取的50株轉化子和野生型菌株在葡萄綠枝條和蘋果果實上的病斑大小Table 1 Lesion size on grapevine green shoots and apple fruit after inoculation with wild type strain and the 50transformants selected randomly

3 結論與討論

對枝干病害病原菌致病力的評價，通常采用接種綠枝條的方法。Chang等［9］、Rozsnyay和 Apostol［10］分別用桃和櫻桃綠枝條作為寄主對病原菌的致病性進行評價，發現評價結果與田間活體接種結果一致。林月莉等將B.dothidea分別接種蘋果綠枝條、蘋果果實及蘋果葉片，3種材料的接種結果與田間接種蘋果枝條的試驗結果一致［11］。葡萄潰瘍病菌轉化子致病力的評價也可應用一年生葡萄枝條，Urbez－Torres［12］在2008年用一年生葡萄綠枝條比較 Lasiodiplodia theobromae （B.rhodina）和Diplodia seriata （B.obtusa）的致病力強弱；本研究室燕繼曄［7］等在2012年利用同樣的方法評價了分離自4個不同地方的B.dothidea單孢菌株在25個不同葡萄品種上的致病力。但在進行大規模轉化子致病力研究時，由于葡萄綠枝條取材受季節的限制，且需求量大，使得研究工作不能順利進行。因此能夠找到一種可以不受季節限制，并且易獲得的接種材料替代葡萄綠枝條便會加快對轉化子庫致病力突變體的篩選。本研究室已利用此方法完成了25個葡萄品種對B.rhodina的抗性評價，發現‘夏黑’為感病品種，且預試驗發現B.rhodina也可以侵染‘富士’蘋果果實。所以本研究試圖將蘋果果實作為葡萄綠枝條的替代物，結果發現在葡萄綠枝條上致病力減弱的轉化子有96.15%在‘富士’蘋果果實上的致病力也是減弱的。所以‘富士’蘋果果實可以用來對轉化子庫進行初篩獲得致病力減弱的突變體，為進一步研究致病基因提供可能。用蘋果果實代替綠枝條接種，可縮短致病力突變體的篩選周期。

在蘋果果實上沒有篩選到致病力增強的轉化子，推測原因是由于B.rhodina在兩種寄主上的適應力、侵染力不同，較葡萄枝條而言，野生型CSS－01s在‘富士’蘋果果實上的致病力強且發病迅速、無法區別致病力增強的轉化子。

本研究初步建立了利用‘富士’蘋果果實作為寄主替代物篩選致病力減弱轉化子的篩選體系，但該體系尚不完善還需進一步優化，如：蘋果果實品種、品質等等都需進一步優化。若能優化篩選體系，便為后期進一步研究致病基因提供支持，進而為解析葡萄潰瘍病菌致病機理奠定基礎，從而控制該病害在田間的發生，保障葡萄產業的順利發展。

［1］ Yan J Y，Li X H，Kong F F，et al.Occurrence of grapevine trunk disease caused by Botryosphaeria rhodinain China［J］.Plant Disease，2011，95（2）：219.

［2］ Urbez－Torres J R.The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines［J］.Phytopathologia Mediterranea，2011，50（4）：5－45.

［3］ Siebert J B.Eutypa：The economic toll on vineyards［J］.Wines ＆ Vines，2001（4）：50－56.

［4］ Li Xinghong，Yan Jiye，Kong Fanfang，et al.Botryosphaeria dothidea causing canker of grapevine newly reported in China［J］.New Disease Reports，2010，21：25.

［5］ Brown－Rytlewski D E，Mcmanus P S.Virulence of Botryosphaeria dothidea and Botryosphaeria obtusa on apple and management of stem cankers with fungicides［J］.Plant Disease，2000，84（9）：1031－1037.

［6］ Urbez－Torres J R，Gubler W D.Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California［J］.Plant Disease，2009，93（6）：584－592.

［7］ Yan Jiye，Xie Yue，Yao Shengwei，et al.Characterization of Botryosphaeria dothidea，the causal agent of grapevine canker in China［J］.Australasian Plant Pathology，2012，41（4）：351－357.

［8］ Pavlic D.Botryosphaeria species on native South African Syzygium cordatumand their potential threat to Eucalyptus［D］.University of Pretoria，2004.

［9］ Chang L S，Iezzoni A F，Adams G.Excised－shoot assay for tolerance of peach to Leucostoma persoonii［J］.HortScience，1989，24（6）：1011－1012.

［10］Rozsnyay Z S，Apostol J.Breeding for sweet and sour cherry disease resistance in Hungary［C］.ISHS Acta Horticulturae 667：ⅣInternational Cherry Symposium.2001.

［11］林月莉，黃麗麗，高小寧，等.蘋果輪紋病室內快速評價體系的建立［J］.植物保護學報，2011，38（1）：37－41.

［12］Urbez－Torres J R，Leavitt G M，Guerrero J C，et al.Identification and pathogenicity of Lasiodiplodia theobromae and Diplodia seriata，the causal agents of bot canker disease of grapevines in Mexico［J］.Plant Disease，2008，92（4）：519－529.