幾種植物源活性物質(zhì)對昆蟲細胞的毒力測定

楊菁菁， 蔣紅云， 張 蘭， 沈斌斌

（1.華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點實驗室，北京 100193）

生物測定作為一種手段，廣泛應用于新農(nóng)藥的篩選、毒力測定與藥效試驗及抗藥性檢測等方面。毒力測定方法包括藥膜法、浸漬法、噴霧法等，這些方法都是利用活體昆蟲進行生物測定，隨著農(nóng)藥創(chuàng)制的發(fā)展，傳統(tǒng)的生物測定技術的缺點越來越明顯。特別是在研究天然產(chǎn)物中的殺蟲活性物質(zhì)時，由于其含量較低，又有協(xié)同、拮抗效應，致使工作量加大，成本較高，周期長，已不能滿足批量新化合物活性篩選的需要，因此，需要一些新的篩選方法來適應新農(nóng)藥創(chuàng)制的迅速發(fā)展［1］。基于細胞水平的試驗，以微孔板為試驗工具，通過靈敏準確的檢測儀器收集數(shù)據(jù)，具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點，為化合物的大規(guī)模生物活性測定提供了一種有效的方法［2－3］。

利用離體昆蟲細胞代替活體進行活性測定是一種直接反映化合物毒性作用的檢測方法。本試驗研究了幾種植物源活性物質(zhì)對甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾［Spodoptera frugiperda （Smith）］Sf 9細胞的增殖抑制活性，旨在從細胞水平上探討幾種植物源活性物質(zhì)的殺蟲活性及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試細胞：甜菜夜蛾中腸脂肪體細胞IOZCASSPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾胚胎細胞Sf 9，本實驗室培養(yǎng)（中國科學院動物研究所贈送）。IOZCAS－SPEX－Ⅱ細胞培養(yǎng)于 Hink’s TNM （Sigma，USA），Sf 9細胞培養(yǎng)于Sf－900TMII SFM （Invitrogen，USA）。培養(yǎng)基添加10% 胎牛血清（Invitrogen，USA），100U青霉素和100U鏈霉素。培養(yǎng)條件為（26±1）℃，RH70%～80%，每4～6d傳代一次。

供試藥劑、試劑及儀器：喜樹堿（camptothecin）（99.17%）和羥基喜樹堿 （hydroxycamptothecin）（99.44%）購買于四川南部縣誠信科技有限公司；魚藤酮 （rotenone）（95%）和 印 楝 素 （azadirachtin）（95%）購于美國Sigma公司；烏頭堿（aconitine）、次烏頭堿（hypaconitine）、偽石榴皮堿（pseudopelletierine）、馬錢子堿（strychnine）和吳茱萸堿（evodiamine）為購于中國藥品生物制品檢定所的標準品；DMSO（英國Invitrogen公司；99.9%）、CellTiter 96?AQueous One Solution細胞增殖試劑盒購于美國Promega公司；HPS－160培養(yǎng)箱購于哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；TECAN infinite M200 pro酶標儀購于瑞典Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 植物源活性物質(zhì)溶液配制

喜樹堿、羥基喜樹堿、烏頭堿和馬錢子堿分別溶于DMSO中配制1.0×104μmol／L，放在4℃冰箱保存；次烏頭堿溶于DMSO中配制6.65×104μmol／L；吳茱萸堿溶于 DMSO 中配制5.6×104μmol／L；偽石榴皮堿溶于DMSO中配制1.142×105μmol／L，放在4℃冰箱保存，使用液用DMSO稀釋至所需濃度。

1.2.2 植物源活性物質(zhì)對昆蟲細胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的IOZCAS－SPEX－Ⅱ 和Sf 9細胞，調(diào)整培養(yǎng)細胞濃度為105個／mL。根據(jù)CellTiter 96?AQueous One Solution試劑盒說明書，以每孔80μL接種96孔板，12h后，分別加入喜樹堿、羥基喜樹堿、烏頭堿、次烏頭堿、馬錢子堿、吳茱萸堿、魚藤酮和印楝素使其終濃度為1.0×10－3、1.0×10－2、1.0×10－1、1.0×100、1.0×101、1.0×102μmol／L，對照組加入 DMSO（1μL），每個濃度設3個平行孔。培養(yǎng)2、6、12、24、48、72h后，分別加入CellTiter 96?AQueous One試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標儀在490nm處測定吸光度，按下面公式計算細胞生長抑制率：

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 幾種植物源活性物質(zhì)對Sf 9細胞增殖的抑制活性

如圖1所示，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對Sf 9細胞生長的抑制性明顯高于其他植物源活性物質(zhì)。在同一時間內(nèi)，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮隨著濃度的升高，對Sf 9細胞生長抑制性逐漸升高，說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對細胞毒性有明顯的劑量效應。在同一濃度時，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對Sf 9的抑制活性隨著時間的改變也發(fā)生了變化，表明這3種植物源活性物質(zhì)對Sf 9細胞的增殖抑制作用具有時間依賴性。而烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、馬錢子堿、印楝素及吳茱萸堿在同一時間內(nèi)，隨著濃度的升高，對Sf 9細胞的生長抑制率總體上沒有明顯差異，但是這幾種植物活性物質(zhì)其對細胞均有一定的毒性。

2.2 幾種植物源農(nóng)藥對IOZCAS－SPEX－Ⅱ細胞的增殖抑制活性

從圖2可以看出：喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮在同一時間內(nèi)，隨著濃度的降低，對甜菜夜蛾IOZCAS－Spex－Ⅱ細胞生長抑制率逐漸降低，細胞的生長存活率升高；同時，在同一濃度，隨著時間的不斷延長，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮12h與其他時間有著顯著性差異，說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮在12h中對細胞的抑制性達到了頂峰。喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對細胞的生長抑制性明顯高于其他植物活性物質(zhì)，這說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對細胞的毒性遠遠高于其他幾種活性物質(zhì)。而烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、印楝素、馬錢子堿和吳茱萸堿在同一時間隨著濃度的降低，甜菜夜蛾SPEX－Ⅱ細胞的生長抑制率沒有明顯的變化；同時，在同一濃度中，隨著時間的不斷延長，在12h中與其他時間存在著顯著差異，這也說明其活性物質(zhì)本身對細胞液有一定的毒性，從而產(chǎn)生抑制細胞生長的效果。

圖1 不同植物活性物質(zhì)在不同時間不同濃度對Sf 9細胞增殖的抑制作用Fig.1 Propagation inhibition of Sf 9cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

圖2 植物活性物質(zhì)對IOZCAS－SPEX－Ⅱ細胞增殖的抑制率Fig.2 Propagation inhibition of IOZCAS－SPEX－Ⅱ cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

3 討論

隨著生物技術的發(fā)展，細胞工程已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外學者的重視。基于細胞水平的篩選具有靶標均質(zhì)性好，試驗條件容易控制等優(yōu)點，利用24孔板、96孔板，使得待測化合物變得越來越微量化，篩選成本更低，篩選量更大，這對篩選化合物庫中的活性物質(zhì)具有重要的意義。Stipanovic等［4］測定了棉酚系列天然產(chǎn)物對煙芽夜蛾［Heliothis virescens（Fabricius）］細胞系的毒力，試驗結果與活體毒力測定和田間小區(qū)試驗有良好的相關性。張志祥等［5］利用MTT法對19種茼蒿素類似物進行了離體細胞篩選，取得了良好的試驗結果。

本試驗采用在不同時間不同濃度下，測定不同植物源活性物質(zhì)對甜菜夜蛾IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾Sf 9細胞的增殖抑制性。在本試驗體系（100μL）中，DMSO使用劑量均為1μL，在測定的時間范圍內(nèi)（2、6、12、24、48、72h），該劑量下 DMSO對兩種昆蟲細胞的增殖抑制率范圍均為3%～5%。結果表明，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對昆蟲細胞的增殖具有良好的抑制作用，并且具有時間和劑量效應。烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、印楝素、馬錢子堿和吳茱萸堿對IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾Sf 9細胞也具有一定的毒性，但是不具有明顯的劑量效應。如烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、馬錢子堿和吳茱萸堿對Sf 9細胞毒性結果出現(xiàn)隨著劑量升高抑制效果下降，一定程度的波動現(xiàn)象，但不具有顯著的劑量關系，這可能與試驗存在一定的誤差，設置濃度極差較大，植物源活性物質(zhì)具有不同的作用機制有關。昆蟲細胞離體篩選的主要是呼吸抑制劑、核酸與蛋白質(zhì)合成抑制劑等，而對于其他作用方式的化合物，則很難直接利用離體細胞進行測定。如有神經(jīng)毒性的化合物，由于細胞中沒有神經(jīng)突觸，化合物在細胞體系中因找不到相應的靶點而毒力相對較低，甚至表現(xiàn)為無毒，有時可能會漏篩一些具有高活性的化合物［6－7］。因此，基于離體細胞的生物測定，可以作為活體篩選的補充手段，同時也可作為一種藥物作用機理研究的有效工具。

［1］ 周青春，萬樹青，劉釗杰.利用MTT法測定殺蟲劑對細胞的毒力［J］.植物保護學報，1996，23（4）：343－348.

［2］ 邱立紅，張文吉，王成菊，等.高通量篩選在新農(nóng)藥創(chuàng)制研究中的應用［J］.農(nóng)藥科學與管理，2002，23（5）：20－25.

［3］ Jensen N A，Gerth K，Grotjohann T，et al.Establishment of a high content assay for the identification and characterization of bioactivities in crude bacterial extracts that interfere with eukaryotic cell cycle［J］.Journal of Biotechnology，2009，140（1－2）：124－134.

［4］ Stipanovic R D，Elissalde M H，Altman D W，et al.Cell culture bioassay to evaluate allelochemical toxicity to Heliothis virescens （Lepidoptera：Noctuidae）［J］.Journal of Economic Entomology，1990，83（3）：737－741.

［5］ 張志祥，徐漢虹，程東美，等.利用MTT法以茼蒿素類似物對昆蟲細胞毒力篩選及測定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2000，21（3）：29－32.

［6］ 徐紅星，俞曉平，陳建明，等.殺蟲劑離體細胞生物測定研究［C］∥楊懷文.第三屆全國綠色環(huán)保農(nóng)藥新技術、新產(chǎn)品交流會暨第二屆全國生物農(nóng)藥研討會論文集.北京：中國學術期刊電子雜志社，2004：227－230.

［7］ 鄭丙蓮，楊紅，洪華珠，等.八種昆蟲離體細胞系對滅多威農(nóng)藥的敏感性研究［J］.生物技術通報，2000（5）：30－36.