實時熒光RT-PCR在人感染H7N9禽流感病毒檢測中的應(yīng)用

華哲云，褚 維，宋黎黎，王 宇，高淑娜，勞寶法

(上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200023)

2013年4月1日，中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會向世界衛(wèi)生組織(WHO)通報了3例人感染H7N9禽流感病例。引起此次疫情的H7N9禽流感病毒[avian influenza A(H7N9)virus 2013]是一種新型的重組禽流感病毒，其基因組8個片段中血凝素(hemagglutinin，HA)基因來自北京燕雀 A(H7N3)，神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因來自韓國野禽A(H7N9)，其余6個基因片段均來自浙江鴨A(H9N2)[1]。人感染H7N9禽流感病情發(fā)展迅速，可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征，死亡率極高[2]。由于人感染H7N9禽流感臨床癥狀的非特異性，對疫情的確診和控制只能依賴于實驗室的檢測結(jié)果，所以建立一套穩(wěn)定的H7N9病毒核酸實驗室檢測方法是疫情防控的關(guān)鍵。為此，我們對4種不同的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑開展了檢測效果比對，以確立檢測方法并提供更可靠的實驗結(jié)果，同時還分析了不同標(biāo)本的病毒核酸檢出情況，為今后不明原因肺炎及禽流感病例監(jiān)測的采樣工作提供建議。

材料和方法

一、對象

1.病例定義 人感染H7N9禽流感監(jiān)測病例需同時具備以下4項條件:(1)發(fā)熱(腋下體溫≥38℃以上;(2)具有肺炎的影像學(xué)特征;(3)發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)降低或正常，或淋巴細(xì)胞分類計數(shù)減少;(4)不能從臨床或?qū)嶒炇医嵌仍\斷為常見的病原所致肺炎[3]。

2.標(biāo)本類型、采集、保存和運輸 及時采集患者上呼吸道標(biāo)本(鼻咽拭子、鼻腔抽取物、咽漱液和鼻洗液等)和下呼吸道標(biāo)本(氣管吸取物、肺泡灌洗液、痰液等)。拭子標(biāo)本采集使用塑料桿的聚酯纖維拭子，采集后的標(biāo)本置于3 mL病毒采樣液中，4℃保存，并使用生物安全轉(zhuǎn)運裝置及時將標(biāo)本送至本實驗室。從2013年4月1日至5月8日，一共收到137例人感染H7N9禽流感病毒的臨床監(jiān)測及可疑病例標(biāo)本。

二、檢測方法

1.病毒核酸的抽提 吸取140 μL標(biāo)本液，加入套管內(nèi)，置于QIAcube全自動核酸純化系統(tǒng)中，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)配套程序進行病毒核酸的提取，抽提產(chǎn)物存儲于100 μL無RNA酶水中，4℃保存待檢。

2.病毒核酸的檢測 在ABI7300熒光定量PCR檢測儀(美國Life Technologies公司)上使用4種實時熒光RT-PCR試劑對標(biāo)本進行檢測。其中1種為國家流感中心(CNIC)下發(fā)引物探針配合Superscript III platinum one-step qRT-PCR system試劑盒(美國Invitrogen公司)進行病毒的核酸檢測，引物探針序列信息見表1，反應(yīng)體系配制見表 2。反應(yīng)程序為 45℃ 10 min、95℃10 min、(95℃ 15 s、60℃ 45 s)×40循環(huán)，60 ℃采集核酸擴增熒光信號[4];另3種為市售商品化試劑盒(簡稱A、B和C)，反應(yīng)體系配制及程序設(shè)置均按照試劑盒推薦方法進行操作。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。對4種試劑的平均Ct值使用Friedman檢驗(氟里得曼雙向評秩方差分析)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物探針序列

表2 反應(yīng)體系配制

結(jié) 果

一、H7N9禽流感病毒陽性檢出率

137例臨床標(biāo)本中檢出5例陽性，陽性率為3.65%(5/137)。4種熒光定量RT-PCR試劑檢測陽性結(jié)果完全相符。人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性曲線見圖1。

二、4種試劑的檢測效果評估

比較5例H7N9禽流感病毒核酸陽性標(biāo)本的檢測Ct值。A試劑盒的Ct值低于其他試劑(P=0.025)，見表 3。

圖1 CNIC下發(fā)引物探針檢測H7N9禽流感病毒陽性擴增曲線

表3 4種試劑平行檢測H7平均Ct值比較

三、不同來源標(biāo)本的檢測結(jié)果分析

5例陽性病例分別在不同標(biāo)本中檢出。上呼吸道標(biāo)本陽性檢出率為60%(3/5)，下呼吸道標(biāo)本檢出率為100%(5/5)，檢出情況見表4。

表4 不同來源標(biāo)本檢測結(jié)果的比較

討 論

H7N9禽流感病毒是一種新型重組的甲型流感病毒，2013年2月在中國華東地區(qū)首發(fā)并呈高度散發(fā)狀態(tài)。截至2013年5月17日，全國共發(fā)生人感染H7N9禽流感確診病例131例[5]。人感染H7N9禽流感發(fā)病初期為常見的流感樣癥狀，但其病程進展迅速，可在5～7 d內(nèi)發(fā)展成重癥肺炎，甚至并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征，死亡率極高。目前我國人感染H7N9禽流感死亡病例為36例，死亡率高達(dá)27.5%。由于此疾病沒有特異的臨床癥狀，需要借助實驗室檢測結(jié)果與其他嚴(yán)重急性呼吸道感染疾病進行鑒別診斷，所以快速準(zhǔn)確的實驗室檢測方法是此次疫情防控和臨床救治的關(guān)鍵。實時熒光RT-PCR技術(shù)作為一項快速、高度敏感、高度特異和可高通量檢測的新型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原微生物核酸的檢測，對于此次人感染H7N9禽流感病毒疫情的實驗室檢測也是首選的方法。作為國家級流感檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室，上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實驗室在此次疫情的處置工作中，應(yīng)用實時熒光RT-PCR進行了人感染H7N9禽流感病毒的核酸檢測。

本研究應(yīng)用CNIC下發(fā)的引物探針和3種市售商品化H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒同時進行了標(biāo)本的檢測，并對檢測效果進行評估，以確立本實驗室的檢測方法，為疫情防控和臨床治療提供穩(wěn)定可信的檢測結(jié)果。檢測結(jié)果顯示，目前3種市售商品化試劑盒與CNIC下發(fā)引物探針的檢測結(jié)果符合率為100%。4種試劑均能有效檢測出H7N9禽流感病毒核酸。由于A試劑盒在其擴增程序中增加了5個循環(huán)的預(yù)擴增，其最終的檢測結(jié)果Ct值均低于其他試劑盒Ct值，所以在核酸含量較低的情況下，使用A試劑盒更易判斷檢測結(jié)果。

宋黎黎等[6]報道，不同采樣部位的標(biāo)本其流感病毒的檢測結(jié)果存在差異。本研究比較了不同采樣部位標(biāo)本的H7N9禽流感病毒核酸檢測效果。在5例陽性標(biāo)本中，共收集了5份上呼吸道標(biāo)本(鼻咽拭子)和3份下呼吸道標(biāo)本(痰液及肺部灌洗液)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下呼吸道標(biāo)本的陽性檢出率更高，為100%(3/3)，而上呼吸道標(biāo)本的陽性檢出率為60%(3/5)。說明H7N9禽流感病毒與其他禽流感病毒相似，對人下呼吸道更為敏感[7-8]。因此，在今后的不明原因重癥肺炎，特別是禽流感疑似病例的監(jiān)測采樣中，建議在有條件的情況下盡量采集患者的下呼吸道標(biāo)本，以提高病毒核酸的陽性檢出率。

[1]Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus[J].N Engl J Med，2013，368(20):1888-1897.

[2]Li Q，Zhou L，Zhou M，et al.Preliminary report:epidemiology of the avian influenza A (H7N9)outbreak in China [J].N Engl J Med，2013[Epub ahead of print].

[3]中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)[EB/OL].(2013-04-11)[2013-06-10].http://www.gov.cn/gzdt/2013-04/11/content_2374926.htm.

[4]World Health Organization.WHO CC Beijing real-time RT PCR(rRT-PCR)protocol for detection of a(H7N9)avian influenza virus(Version 22013)[EB/OL].(2013-04-15)[2013-06-10].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.

[5]World Health Organization.Human infection with avian influenza A(H7N9)virus– update[EB/OL].(2013-05-17)[2013-06-10].http://www.who.int/csr/don/2013_05_17/zh/index.html.

[6]宋黎黎，趙百慧，褚 維，等.采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出情況[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23(4):892-895.

[7]張增峰，樊曉暉，李康生，等.人呼吸道禽流感病毒受體的分布趨勢[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2008，35(12):1387-1393.

[8]張增峰，樊曉暉，陳曉燕，等.禽流感病毒H9N2在人肺組織的復(fù)制[J].病毒學(xué)報，2013，29(2):206-210.