三七總皂苷對HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用研究

黃美春 胡 剛 朱蕓蕓 丁慧登 魯 盈 浙江省立同德醫院腎內科 杭州 310012

三七總皂苷對HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用研究

黃美春 胡 剛 朱蕓蕓 丁慧登 魯 盈 浙江省立同德醫院腎內科 杭州 310012

目的：觀察三七總皂苷對肝素結合性表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF）誘導大鼠腎小球系膜細胞增殖的作用。方法：以原代培養大鼠腎小球系膜細胞為細胞模型，以400ng/mL三七總皂苷和100ng/mL HB-EGF為干預因素，實驗分對照組、100ng/mL HB-EGF組和400ng/mL三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF組，刺激系膜細胞24、36、48h，采用MTT方法，觀察三七總皂苷對重組HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用情況。結果：HB-EGF刺激36h時，系膜細胞明顯增殖，與對照組比較，P＜0.05；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導的系膜細胞的增殖，與HB-EGF組比較，P＜0.05。隨著刺激時間的延長，三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的抑制作用增強，但36h與24h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與48h比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用，且作用隨著刺激時間延長而增強。三七總皂苷可能通過抑制HB-EGF對系膜細胞增殖作用而延緩腎小球硬化。

HB-EGF 系膜細胞 細胞增殖 三七總皂苷

三七屬活血化瘀藥物，中醫臨床常用于多種腎臟病的治療，并取得了一定療效。三七總皂苷是三七最主要的生物活性成分，具有抑制系膜細胞增生、細胞凋亡、細胞因子分泌等多種作用[1]。肝素結合性表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding epidermal growth factor like growth factor，HB-EGF）是近年來新發現的、國內外研究熱門的肽類生長因子，研究表明其在多種腎臟病變中起重要作用，尤其在缺血損傷腎臟病變，致腎臟病變進展[2]。本研究觀察三七總皂苷對HB-EGF誘導腎小球系膜細胞增殖的作用，以進一步認識三七總皂苷治療腎臟病的作用機制，及其臨床應用前景。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康SD大鼠2只，體質量150～200g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（滬 2003-003），飼養于清潔環境、溫度 20～22℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物及試劑 三七總皂苷（云南植物藥廠）；HB-EGF（R＆D systems）；RPMI-1640 培養基（Gibco BRL公司)；胎牛血清（FCS，杭州四季青生物技術公司）；?型膠原酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（華美生物科技公司）；MTT試劑盒（凱基生物科技發展公司）。

2 實驗方法

2.1 腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）的原代培養及鑒定 系膜細胞原代培養和鑒定方法參見文獻[3]。正常SD雄性大鼠2只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，清潔取腎，去髓質，剁碎皮質，經120、80、200目篩網碾磨、過濾，在200目上收集腎小球，5mg/mL的Ⅳ膠原酶消化10min，洗滌后接種于含20%FCS的RPMI1640培養基的塑料培養瓶中，5%CO2、37℃培養箱孵育，當GMC長至80%融合時用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化傳代。系膜細胞按常規方法進行電鏡、免疫組化方法鑒定。取3～6代細胞用于實驗。

2.2 三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用 應用MTT法測定細胞增殖。實驗分對照組、100ng/mL HB-EGF組和 400ng/mL三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF組，每組設4個復孔。取系膜細胞，以 1×104/孔接種于 96 孔培養板，每孔 200μL，培養48h后，換用無FCS的培養基培養24h，細胞同步化后去上清，分別加入所需濃度的2%FCS培養基200μL，刺激培養36h；同時按上述方法，三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF 組刺激培養 24h、36h、48h。在結束前4h每孔加5mg/mL MTT 20μL，于CO2培養箱繼續孵育4h，小心吸取上清，每孔加DMSO 200μL，震蕩10min后，490nm波長測吸光度。

3 實驗結果

3.1 三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用 在刺激系膜細胞36h時，HB-EGF能刺激系膜細胞增殖，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用，與HB-EGF組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用（±s）

表1 三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 100ng/mLHB-EGF 組比較，△P＜0.05

組 別對照組100ng/mLHB-EGF 組三七總皂苷+100ng/mLHB-EGF組n/孔P值444 OD值0.4109±0.0074 0.5503±0.0061*0.4210±0.0066△0.062 0.000 0.000

3.2 不同刺激時間三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的作用 隨著刺激時間的延長，三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的抑制作用增強，但36h與24h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；48h與36h比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 不同時間三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的抑制作用（±s）

表2 不同時間三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的抑制作用（±s）

注:與 36h 比較，▲P＜0.05

時間24h 36h 48h n/孔p 444 OD值0.4247±0.0095 0.4210±0.0066 0.4031±0.0096▲0.560 0.015

4 討論

HB-EGF是1991年Higshiyame等首先發現的一種肽類生長因子，屬于表皮生長因子家族，在體內廣泛分布，與胞膜上EGF受體緊密結合，通過PKC和Ca2+信號途徑發揮作用，參與多種病理生理過程，認為與傷口愈合、缺血再灌注損傷、先兆子癇、哮喘、冠狀動脈病變等多種疾病密切相關，故成為近年來國內外研究熱點[4-5]。HB-EGF 在腎臟方面的研究也越來越受關注。研究發現，HB-EGF與多種腎小球疾病﹙尤其在缺血再灌注腎損害、系膜增生性腎炎等﹚密切相關，筆者研究發現HB-EGF能促進系膜細胞增生和TGF-β的分泌和表達[6]。進一步研究發現HBEGF/EGFR通路在腎小球疾病（尤其急進性腎小球腎炎）起關鍵作用，認為是腎小球疾病的一個新的治療靶點，打開了EGFR阻滯劑的臨床應用前景[7-8]。故探討中醫藥在HB-EGF/EGFR通路的作用具有重要臨床意義。

三七具有活血化瘀作用，臨床治療慢性腎小球腎炎等多種腎臟病取得良好療效，延緩了慢性腎臟病的進展。研究表明，三七的生物活性成分三七總皂苷能抑制系膜細胞增殖，通過抗氧化應激抑制誘導足細胞凋亡，抑制多種細胞因子分泌等作用，在抗腎小球硬化和腎間質纖維化治療中具有良好療效[9]。研究證實，在腎外血管內皮細胞損傷修復中起重要作用，對肺血管內皮細胞有損傷修復作用，能改善人臍靜脈內皮細胞分泌功能，減輕缺氧再給氧損傷[10]。所以，設想三七總皂苷可能對腎臟病變中HB-EGF/EGFR通路起作用，故本課題就三七總皂苷對HBEGF誘導的系膜細胞增殖作用方面做進一步研究，開拓三七總皂苷在腎臟病的應用前景。

本研究發現，在刺激36h時HB-EGF能刺激系膜細胞增殖（與對照組比較，P＜0.05）；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用（與HBEGF組比較，P＜0.05）。在不同刺激時間，隨著刺激時間的延長，三七總皂苷對HB-EGF誘導系膜細胞增殖的抑制作用增強，但36h與24h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與 48h比較，有顯著性差異（P＜0.05）。說明三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導的系膜細胞增殖作用，且隨著刺激時間延長，抑制作用增強。故推測三七總皂苷可能通過抑制HB-EGF途徑在腎臟病治療中起重要作用。

［1］祝正明，孫建實，趙湘.三七總皂苷對大鼠腎小球系膜細胞CTGF表達及細胞外基質產生的影響［J］.中華中醫藥學刊，2009，27（4）：853-855.

［2］Uttarwar L，Peng F，Wu D，et al.HB-EGF release mediates glucose-induced activation of the epidermal growth factor receptor in mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，300（5）：921-931.

［3］諶貽璞，高進，刑寶才，等.腎小球系膜細胞培養［J］.北京醫科大學學報，1989，21（4）：335-336.

［4］Higashiyama S，Abraham JA，Miller J，et al.A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF［J］.Science，1991，251：936-939.

［5］Pal Gooz1，Yujing Dang1，Shigeki Higashiyama，et al.A Disintegrin and Metalloenzyme（ADAM）17 Activation Is Regulated by a5b1 Integrin in Kidney Mesangial Cells［J］.PLoS ONE，2012，7（3）：1-9.

［6］Luo CC，Ming YC，Chao HC，et al.Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor downregulates expression of activator protein-1 transcription factor after intestinal ischemia-reperfusion injury［J］.Neonatology，2011，99（4）：241-246.

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［9］孫文，馮麗園，趙宗江，等.三七總皂苷干預糖尿病腎病大鼠氧化應激及足細胞凋亡機制的實驗研究［J］.中華中醫藥雜志，2011，26（5）：1062-1067.

［10］江小萍，李海全，潘少霞，等.三七總皂苷對缺氧再給氧血管內皮細胞鈣離子濃度及肌漿網Ca2+-ATP酶活性的影響［J］.中華中醫藥學刊，2011，29（4）：758-761.

Effect of Panax Notoginseng Saponins on proliferation of mesangial cell induced by HB-EGF

HUANG Meichun，HU Gang，ZHU Yunyun，et al.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective：To investigate the influence of panax notoginseng saponins（PNS） on proliferation of mesangial cell induced by heparin-binding epidermal growth factor like growth factor（HB-EGF） and its mechanism in kidney disease.Methods：The primary cultured SD rat mesangial cell were used as cell models.The cells were divided into control group，100 ng/ml HB-EGF group，and 400 ng/ml PNS+100 ng/ml HB-EGF group，and were cultured with these solutions for 24，36，and 48 h，respectively.Cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay.ResultsHB-EGF stimulated the proliferation of mesangial cells in 36 h（compared with control group P＜0.05）but the effect was inhibited by PNS（compared with HB-EGG group P＜0.05），and the effect of inhibition in 48 h was more obvious than that in 36 h（P＜0.05）.But no significant difference in the effect of inhibition was noted between cells treated for 36 h and 24 h（P＞0.05).ConclusionPNS can inhibit the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF，and the effect of inhibition gradually increases with the prolongation of the culture time.PNS may retard the development of glomerular sclerosis by inhibiting the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF.

HB-EGF mesangial cells cell proliferation panax notoginseng saponins

2013-06-05