抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備及其識別抗原表位分析①

張 萃 盧文菊 李紅枝 黃超賢 王華妹 丘世龍 梅儷凡

(廣東藥學院微生物學與免疫學教研室，廣州510006)

瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(Transient receptor potential channel，TRPC6)是瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)一個亞群，Winn等2005年首次報道TRPC6通道位于腎小球足細胞，是裂隙膜的重要組成部分，編碼足細胞結構蛋白，其表達量的改變可導致大量蛋白尿，從而引起局灶節段性腎小球硬化和進行性腎衰竭［1］。隨著研究的深入，在機體多個系統發現有TRPC6通道的存在，并與多種疾病關系密切，近年來成為研究熱點［2，3］。測定 TRPC6的表達多在核酸水平上檢測和免疫印跡法測定蛋白表達，所應用的多以TRPC6的多克隆抗體為主。基于單克隆抗體的諸多優勢，本文在制備抗TRPC6多肽的單克隆抗體基礎上，結合生物信息學分析單克隆抗體的表位識別特性，為進一步的TRPC6基礎研究和臨床檢測提供新途徑。

1 材料與方法

1．1 動物和細胞株 SPF級6周齡BALB/c小鼠，雌性，購自廣東省醫學實驗動物中心，批號為SCXK(粵)2008-0002，飼養2周適應環境后用于免疫;P3-X63-Ag8．653小鼠骨髓瘤細胞系，由本室劉曉波教授贈送，購自ATCC，本室保存。

1．2 主要試劑 優級胎牛血清，購自天津市灝洋生物制品科技公司;RPMI1640培養基購自Gibco公司;HAT、HT、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自美國Sigma公司;羊抗小鼠IgG-HRP，購自Earth-Ox公司;PEG4000，購自美國Sigma公司;96孔培養板、培養瓶、酶標板均購自德國CORNING公司;TRPC6多肽合成的各種氨基酸、KLH均由上海強耀生物科技有限公司提供。

1．3 小鼠免疫及抗TRPC6多克隆抗體的檢測 一次免疫3只小鼠，每次取50 μg TRPC6多肽-KLH偶聯物，采取小鼠皮下多點注射法，間隔3周，第三次免疫1周后采血測其效價，選擇高效價者進行加強免疫，加強免疫3天后準備細胞融合，小鼠血清保存備用。

1．4 雜交瘤細胞株的建立 按照傳統單克隆抗體制備技術進行，經有限稀釋法克隆化培養獲得雜交瘤細胞株。并經過反復凍存、復蘇后，鑒定染色體及單抗分泌穩定者建立雜交瘤細胞株。

1．5 抗TRPC6多肽單克隆抗體的特性鑒定

1．5．1 間接ELISA法檢測抗體效價 以10 μg/ml包被 TRPC6多肽(1 μg/孔)，余下步驟按照間接ELISA法常規操作。

1．5．2 雜交瘤細胞株染色體鑒定 采用秋水仙素阻斷法進行染色體計數。

1．5．3 單克隆抗體相對親和力鑒定 包被TRPC6多肽(1 μg/孔)，各株單抗濃度為 100、50、25、12．5和6．25 μg/ml，37℃孵育1 小時，洗滌3 次后加入酶標二抗(1∶5 000)，37℃ 1小時后洗滌，加底物顯色測定，按50%最大結合的單抗計算其相對親和力。

1．5．4 單克隆抗體腹水制備及亞類鑒定 按常規方法取8周齡BALB/c小鼠進行腹水制備。將單抗腹水以1∶100比例開始倍比稀釋，采用間接ELISA檢測其反應效價。同時用HRP標記羊抗小鼠抗體亞類鑒定試劑盒對純化腹水中單抗進行亞類鑒定。

1．5．5 小鼠腦組織總蛋白的提取及TRPC6的檢測腦蛋白蛋白提取采用試劑盒(購于廣州健侖生物科技有限公司);TRPC6蛋白檢測采用間接ELISA法和雙抗體ELISA夾心法。

1．6 單克隆抗體所識別的抗原表位分析

1．6．1 多肽設計及表位預測 應用DNAStar軟件對TRPC6蛋白二級結構和表面特性(如親水性、表面性、抗原性)等進行預測。根據預測結果先后設計一系列連續或非連續性短肽序列(見表1)，方法參考文獻［4］。

1．6．2 肽段的抗原性、親水性和線性表位預測 采用在線IEDB分析工具。

1．6．3 單抗識別抗原的位點分析 采用ELISA單抗相加試驗測定。

1．7 統計學處理 數據通過 SPSS軟件(16．0版本)分析，統計方法為t檢驗，數據用x±s表示。

2 結果

2．1 TRPC6多肽單抗的制備與鑒定

2．1．1 免疫原的制備 經過多肽設計與篩選，獲得P5(KDLTKVTLGDNVKYY)序列，合成多肽，經 MS分析所合成多肽的相對分子質量測定值1 757．03，HPLC分析其純度＞98%。HPLC結果如表2。用合成肽與血藍蛋白KLH偶聯后，作為免疫原備用。

2．1．2 雜交瘤細胞株的建立 經過3次常規小鼠免疫，一次加強免疫后，進行細胞融合和4次亞克隆，最終獲得3株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為A2、H8和F11。經過反復凍存與復蘇，傳代半年以上分泌單抗穩定。

2．1．3 單抗腹水效價測定及其亞類鑒定 常規制備腹水，以合成肽為抗原，將腹水按1∶100開始做倍比稀釋，ELISA方法測定其效價在1∶6 400以上。利用單抗亞型鑒定試劑盒對所建立的3株單抗進行亞型鑒定，結果顯示3株單抗均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。

表1 P1～P5的氨基酸序列、長度和位置Tab．1 Sequence，size and location of peptide in P1-P5

表2 P5的HPLC分析Tab．2 HPLC analysis of sequence 5

2．1．4 雜交瘤細胞系染色體分析 通過秋水仙素阻斷法進行染色體計數統計分析，3株雜交瘤細胞的染色體數目相對穩定，由于小鼠骨髓瘤細胞Ag8.653的染色體數為49±7，小鼠體細胞數為40±7，因而雜交瘤細胞的染色體數平均為86±7，細胞中絕大部分染色體為端部著絲點，結果見圖1。

2．1．5 單抗相對親和力測定分析 以純化后的腹水采用ELISA方法測定已知濃度的3株單抗，按達到50%最大結合的單抗濃度分析相對親和性，親和力越大，所需抗體濃度越低。結果3株單抗達到50%最大結合濃度:A2 和H8 均為12．5 μg/ml，F11為6 μg/ml，因此，相對親和力 A2和 H8相近，而F11較強。

2．1．6 單抗特異性檢測TRPC6蛋白 通過間接ELISA檢測三株單抗均能與小鼠腦組織蛋白發生特異性結合，共檢測了10個樣本，平均值為(1．020±0．034)μg/ml，與正常小鼠血清對照(0.101 ±0.003)μg/ml相比，P 值 ＜0．05，結果有顯著性差異，說明單抗具有良好的特異性。

進一步采用雙抗體ELISA夾心法檢測小鼠和大鼠腦蛋白，驗證單抗特異性結合TRPC6蛋白的作用，同樣各自測定10個樣本，小鼠為(0．82±0.02)μg/ml，大鼠為(1．22 ±0．05)μg/ml，結果表明所制備的單抗具有與TRPC6蛋白特異性結合的特性。

圖1 3株雜交瘤細胞染色體鏡下觀察(姬姆薩染色，×1 000)Fig．1 Chromosome image of three screening hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

圖2 P1～P5在人類TRPC6蛋白序列上的位置Fig．2 The location of P1-P5 in human TRPC6 protein

2．2 單抗識別抗原表位的初步鑒定

2．2．1 肽段氨基酸分布及特性預測

2．2．1．1 TRPC6合成肽序列篩選 根據抗原多肽設計原則對TRPC6合成多肽序列進行篩選，一般選擇15個氨基酸的長度較為容易合成純度高的多肽，還要避開TRPC6分子的胞內段。所以要通過IEDB Analysis Recource提供的蛋白質抗原表位在線分析工具進行預測，根據表露性區域初步篩選出5段TRPC6分子肽段，分別為 P1、P2、P3、P4和 P5(見表1)。同時要求所選肽段在人與小鼠中均為保守序列，人與鼠的同源性為88%(2 563/2 903)，人類TRPC6分子蛋白序列分布比對結果見圖2。

2．2．1．2 TRPC6合成肽段篩選結果 在以上序列設計的基礎上，分別預測上述5個肽段氨基酸序列的抗原性、親水性及線性表位，初步篩選出P序列5-KDLTKVTLGDNVKYY為本實驗目的序列，再進一步應用Parker法對P5的親水性進行分析以及利用DNAstar蛋白分析軟件進一步分析確認P5的以上特性，結果最終確定P5為合成肽序列，預測結果見表3。

2．2．2 單抗識別抗原的位點分析 在以上生物信息學預測各種特性基礎上，采用ELISA單抗相加試驗對抗體識別位點的差異進行分析，單抗A2與H8、A2與F11的相加指數分別為51%和60%，大于50%說明可能為識別不同位點;而F11與H8的相加指數為18%，小于50%，可能為識別的同一位點。為了進一步驗證實驗的重復性，經過三次重復實驗，變異系數為1．09% ～9．88%，變異系數 ＜10%，說明離散程度不高，且重復性良好，結果見表4。

表3 TRPC6合成肽的抗原性、親水性和線性表位預測Tab．3 The sequence selection，antigenicity，hydrophilicity and epitope prediction of TRPC6 peptide sequence

表4 3株單克隆抗體相加指數和表位分析Tab．4 Additivity index and epitope analysis of three monoclone antibody

3 討論

抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，抗原通過表位與相應抗體特異性結合，從而引發免疫應答。本實驗綜合運用多個生物信息學軟件對TRPC6蛋白進行表位預測，初步篩選出了符合要求的肽段(P5)作為免疫肽，合成后通過HPLC對多肽進行的純度分析顯示，所合成多肽的純度在98%以上，符合免疫動物要求。運用MS對合成多肽進行分子質量的測定結果顯示多肽的相對分子質量測定值與理論值相符合，以此確保了所合成的多肽與KLH偶聯后可作為目的抗原進行免疫。實驗中所獲得的單抗通過測定抗體親和力結果，進一步驗證了多肽P5與單抗的結合力，說明生物信息學軟件對抗原表位預測的可行性［5］。此外，在對單抗識別位點分析中，若兩株單抗的相加指數＞50%，說明可能是針對不同識別位點的抗體;若＜50%可能是針對同一識別位點的抗體，由此獲得A2與H8配對較好，為進一步ELISA方法學的建立提供條件。

在單克隆抗體鑒定過程中，親和力和特異性的測定很重要。抗體親和力測定方法很多，之所以選擇ELISA方法測定單抗相對親和力，是因為具有敏感性高、重復性好和方便快捷等優點。此外，對于用于臨床診斷和治療上的單抗，選擇的原則應是在保持高度特異性的前提下選用親和力強的單抗［6］。通過以上實驗獲得的3株單抗中F11親和力較強，可用于下一步的免疫標記實驗;進一步對單抗的特異性測定結果表明，所制備的單抗均可以與小鼠和大鼠腦蛋白中的TRPC6結合。因目前尚無標準TRPC6蛋白做對照，而早期研究該蛋白大量分布于神經系統中［7］，所以實驗中初步利用小鼠和大鼠的腦蛋白組織進行測定驗證，結果表明3株單抗均具有與天然TRPC6結合的生物學特性。通過以上研究，抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備與表位分析，將為今后的免疫學方法構建打下良好的實驗基礎。

1 Winn M P，Conlon P J，Lynn K L et al．A mutation in the trpc6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis［J］．Science，2005;308(5729):1801-1804．

2 Dietrich A，Gudermann T．TRPC6［J］．Handb Exp Pharmacol，2007;179(1):125-141．

3 劉若飛，張 萃．瞬時受體電位陽離子通道6作為疾病治療靶點研究進展［J］．國際藥學研究雜志，2012;39(6):474-477．

4 張 萃，梅儷凡，盧文菊 et al．瞬時受體電位陽離子通道蛋白6合成肽的設計與合成［J］．廣東藥學院學報，2011;27(5):514-517．

5 曹 凱，黃 路，林治華et al．分子模擬用于尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2．1限制性CTL表位的篩選［J］．化學學報，2010;68(13)1277-1284．

6 都春海，陳遠雄．單克隆抗體相對親和力和特異性的測定［J］．中國免疫學雜志，1986;2(5):262-265．

7 崔龍彪，金曉航，史 娟．中樞神經系統內的TRPC6離子通道［J］．神經解剖學雜志，2011;27(5):565-570．