黑色素瘤相關抗原MAGE-A2:腫瘤免疫治療新靶點①

姚勝忠 謝 莎 肖燕子 閉水清 謝小薰 肖紹文

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧530021)

癌-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CTA)是一類廣譜的腫瘤特異性抗原。CTA能在多種腫瘤組織中廣泛表達，而在正常組織(除胎盤和睪丸)中幾乎不表達，并且在一些腫瘤患者體內(nèi)可引起免疫反應。基于這些特性，CTA已成為腫瘤免疫治療研究的熱點靶抗原之一，其中一些 CTA如 MAGEA3、NY-ESO-1已進入臨床試驗階段，并在一些腫瘤的治療中收到較好的療效［1，2］。黑色素瘤相關抗原(Melanoma-associated Antigen，MAGE)是CTA家族的重要成員，迄今為止，已鑒定出MAGE家族多個亞家族，其中MAGE-A亞家族包含13個高度同源的基因，依次命名為MAGEA1—A12;MAGE家族成員最大特征是其氨基酸序列存在一個MAGE同源結構域 (MAGE Homology Domain，MHD)。MAGEA2是MAGE-A亞家族的重要成員之一，研究人員對其潛在功能的研究以及其在臨床中的應用不斷深入，現(xiàn)就MAGE-A2基因、mRNA的表達、免疫原性、表達機理和生物學功能方面進行綜述。

1MAGE-A2基因結構

MAGE-A2 又稱為 MAGE2，MGC131923，根據(jù)MAGE-A2在CTA家族中的排名又命名為CT1.2(http://www.CTA.lncc.br/)。De等［3］于 1994 年通過T細胞抗原表位克隆的方法從人類黑色素細胞中分離并鑒定出MAGE-A2，mage-a2基因定位于染色體 Xq28，基因全長3 977 bp，mRNA長1 979 bp，包含3個外顯子，開放閱讀框位于第3個外顯子，編碼蛋白由314個氨基酸組成。

2MAGE-A2表達

研究人員通過RT-PCR和寡核苷酸微矩陣技術，對成年人各種正常組織及20周以上胚胎組織進行檢測，除睪丸、胎兒及成人角蛋白細胞外，均未能檢測到 MAGE-A2 mRNA［3-7］，這表明 MAGE-A2 mRNA在正常組織中的表達具有明顯的限制性。

MAGE-A2 mRNA分別在多種組織類型腫瘤中存在表達。由于MAGE-A2是在黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，因此研究人員檢測了大量黑色素瘤組織樣品，證實了MAGE-A2 mRNA在黑色素瘤中的高表達，但在轉(zhuǎn)移瘤和原位瘤中MAGE-A2 mRNA表達有一定差異，轉(zhuǎn)移瘤表達率為70%(101/145)，而原位瘤表達率為41%(41/100)，在良性黑素細胞痣及發(fā)育異常痣中均未檢測到 MAGE-A2 mRNA［8-12］。在腦腫瘤中，MAGE-A2 mRNA尤其以小兒腦瘤中表達多見，如在小兒室管膜瘤(8/14，57%)、小兒多形性惡性膠質(zhì)瘤(1/9，11%)、小兒成神經(jīng)管細胞瘤(9/15，60%)，其在成人多形性惡性膠質(zhì)瘤(1/20，5%)亦有表達［13，14］。MAGE-A2 mRNA 在肝癌中的表達有一定特點，在分化良好的肝癌組織中不表達，而在低分化及中等分化肝癌組織中有表達［15，16］。另外，在各種類型肺癌中均能檢測到MAGE-A2 mRNA，如腺癌(4/35，11%)、鱗癌(3/14，21%)、小細胞癌(2/3，67%)及非小細胞肺癌(13/46，28%)［17，18］。此外，在漿液性卵巢腺癌(4/19，21%)，卵黃囊瘤(?，25%)和骨肉瘤(23/28，82%)中也檢測到MAGEA2 mRNA［19，20］。

除了腫瘤的臨床標本外，在乳腺癌、結腸癌、胃癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、黑色素瘤干細胞、畸胎瘤、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、橫狀肌肉瘤、甲狀腺癌等多種細胞株也檢測到MAGE-A2 mRNA［4，5，21-28］。

3MAGE-A2的免疫原性

目前已有報道MAGE-A2引起細胞免疫［29］，以下為已鑒定出的MAGE-A2抗原表位。

MAGE-A2蛋白在細胞漿內(nèi)可被降解為短肽(多為九肽或十肽)，在與HLA分子結合后，被遞呈至細胞膜上為 CTL所識別，并誘導細胞免疫應答［30-34］。Akiyama 等［35］聯(lián)合 MAGE-A2157-166肽段與其他黑色素瘤相關抗原肽段如MAGE-1、3制備多重黑素瘤相關抗原負載的DC疫苗，在9位轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者腹股溝皮下進行注射。除短暫的肝臟異常外，該疫苗對患者無明顯全身反應;9位患者中有6位患者可檢測到超過2種黑色素瘤相關抗原的CTL，而患者1和6展示了顯著的腫瘤退化現(xiàn)象，尤其在患者1體內(nèi)，肺黑色素瘤出現(xiàn)明顯退化。與注射疫苗前相比，5個患者體內(nèi)Th1比例更高，3個患者對于復合疫苗顯示出明顯的遲發(fā)型變態(tài)反應。最后，研究組對疫苗注射后的患者臨床反應進行檢測，分別從PD(Progressive disease，疾病進展)、SD(Stable disease，疾病穩(wěn)定)、PR(Partial response，部分緩解)、CR(Complete response，完全緩解)方面進行觀察，在患者1體內(nèi)，黑色素瘤在肺癌中的轉(zhuǎn)移灶及肺門淋巴結尺寸明顯減小，并且隨著疫苗注射肺門淋巴結最后幾乎完全消失。注射疫苗后，患者1、2、6有明顯的CTL應答反應，且伴隨明顯的CTL增加，而患者4、5、7無CTL應答反應，且除患者7外其他均無明顯的CTL增加。上述研究顯示出負載DC的黑色素瘤復合疫苗確實在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤體內(nèi)有一定作用，且其臨床反應也顯示出較強的抑制作用，但在所選的患者中，出現(xiàn)明顯異質(zhì)性，這可能與患者個體異質(zhì)性有關，目前還不清楚其具體機制。

4MAGE-A2的表達機理

表1 MAGE-A2抗原表位Tab．1 MAGE-A2 Epitopes

Shichijo等［36］首先發(fā)現(xiàn)通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC(5-Aza-CdR)，可誘導淋巴細胞性白血病的腫瘤細胞和T細胞系(經(jīng)植物血凝素/白細胞介素-2刺激)和B細胞系(EB病毒感染)表達MAGE-A2。隨后，Sigalotti等［37］分析56名皮膚黑色素瘤患者腫瘤組織中MAGE-A2的表達與其啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)在MAGE-A2陽性的腫瘤組織中，其啟動子區(qū)域為非甲基化狀態(tài)，而在MAGE-A2陰性的腫瘤組織中，其啟動子區(qū)域為甲基化。用DAC處理MAGE-A2陰性的黑色素瘤細胞株后，可誘導MAGE-A2表達。為了進一步驗證甲基化對MAGEA2表達調(diào)控，他們還構建MAGE-A2啟動子的報告基因質(zhì)粒，將該質(zhì)粒進行甲基化處理后，分別將經(jīng)甲基化處理和未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑色素瘤細胞株中，結果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒顯示報告基因活性，這說明了啟動子甲基化對于MAGE-A2的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。Takahito等［28］發(fā)現(xiàn)在低表達MAGE-A2的前列腺癌細胞株中，用DAC處理可上調(diào)MAGE-A2表達。另一研究報道也顯示用DAC處理后的白血病、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和結腸癌細胞株，MAGE-A2表達明顯上調(diào)，而這種現(xiàn)象僅發(fā)現(xiàn)在MAGE-A2低表達的細胞株［38］;另外，該研究還發(fā)現(xiàn)乙酰化轉(zhuǎn)移酶TSA(Trichostatin A，曲古抑菌素A)能協(xié)同DAC上調(diào)MAGE-A2表達，聯(lián)合應用DAC和TSA處理細胞株可使MAGE-A2上調(diào)率更高，而單獨使用TSA僅微弱上調(diào)MAGE-A2的表達;為了功能性地檢測DNA去甲基化和組蛋白乙酰化對啟動子活性的影響，進一步通過構建含報告基因的MAGE-A2啟動子質(zhì)粒，將其甲基化處理后，分別將經(jīng)甲基化處理和未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不表達MAGE-A2的乳腺癌細胞MCF-7，結果發(fā)現(xiàn)與非甲基化質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染甲基化質(zhì)粒的組別其啟動子活性下降明顯，然而，轉(zhuǎn)染甲基化質(zhì)粒的細胞經(jīng)TSA處理后，啟動子活性上升，而轉(zhuǎn)染非甲基化質(zhì)粒的細胞經(jīng)TSA處理后，啟動子活性上升明顯，這些結果說明MAGE-A2的轉(zhuǎn)錄不但受甲基化的調(diào)控，而且也與乙酰化有關。然而，在表達MAGE-A2的卵巢癌細胞株中，DAC處理細胞卻下調(diào)MAGE-A2表達，這可能與不同細胞對DAC的反應不同有關［39］。

甲基化CpG結合域蛋白(Methyl-CpG binding domain proteins，MBD)是一類結合在甲基化的CpG位點起轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白，為了深入探討甲基化對 MAGE-A2 表達的調(diào)控，Wischnewski等［40］研究了目前較熱門的幾種 MBD，如 MBD1、MBD2a和MeCP2，電泳遷移率檢測結果顯示MBD1與甲基化和非甲基化的MAGE-A2啟動子都有親和力，而使用針對MBD1和MeCP2的染色質(zhì)免疫沉淀技術后，結果顯示MAGE-A2基因表達上調(diào)，而 MeCP2對MAGE-A2親和力更高，這表明MBD1和MeCP2可抑制MAGE-A2啟動子活性。另外，體外構建甲基化及非甲基化的MAGE-A2啟動子質(zhì)粒，與MBD1共同轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株和MBD1缺失的小鼠細胞，結果發(fā)現(xiàn)在這兩種細胞株中，轉(zhuǎn)染甲基化MAGE-A2啟動子質(zhì)粒的組別，MAGE-A2啟動子活性幾乎全部消失，而轉(zhuǎn)染非甲基化MAGE-A2啟動子質(zhì)粒的組別MAGE-A2啟動子活性有下降，說明MBD1可抑制MAGE-A2表達，然而對MBD2a及MeCP2進行同樣研究，結果卻發(fā)現(xiàn)MBD2a可上調(diào)MAGE-A2啟動子活性，而MeCP2對MAGE-A2啟動子活性并無影響。上述結果顯示甲基化抑制MAGE-A2表達機理是涉及多種MBD的共同作用。

5MAGE-A2的生物學功能

對MAGE-A2的生物學功能研究表明，MAGEA2可抵抗多種腫瘤藥物的作用。Duan等［41］將MAGE-A2轉(zhuǎn)入紫杉醇敏感的人卵巢癌細胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細胞產(chǎn)生了明顯的抗紫杉醇及抗阿霉素作用，表現(xiàn)出顯著的生長優(yōu)勢。另外，通過siRNA敲除雄激素敏感的前列腺癌細胞株LNCaP中MAGEA2表達，隨后用一種類紫杉醇藥物多西他奇(Docetaxel)處理細胞株，結果發(fā)現(xiàn)與敲除MAGE-A2前的細胞株相比，敲除后的細胞株生存率明顯下降，進一步佐證MAGE-A2所致的細胞抗耐藥性［28］。還有研究發(fā)現(xiàn)MAGE-A2與抑癌基因p53的結合，可募集組蛋白去乙酰化酶至p53的轉(zhuǎn)錄起始位點達到抑制p53轉(zhuǎn)錄的作用;同時，通過DAC上調(diào)MAGE-A2表達后，黑色素瘤細胞對抗腫瘤藥物依托泊甙的抗藥性增加，這種抗藥性的改變是依賴于p53活性改變而隨之改變;將原來高表達MAGE-A2的黑色素瘤細胞，通過siRNA下調(diào)其表達，結果發(fā)現(xiàn)p53活性恢復，腫瘤細胞的抗藥性也隨之恢復，從而驗證了MAGE-A2通過組蛋白乙酰化酶影響p53活性而從達到抗腫瘤藥的功效［42］。有研究發(fā)現(xiàn)沉默前列腺癌細胞株中MAGE-A2表達，細胞增殖受到明顯抑制，提示MAGE-A2可能在前列腺癌進展過程中起到重要作用，其機制尚不清楚;另外，該研究還發(fā)現(xiàn)MAGE-A2在去勢治療無效的前列腺癌患者中呈高表達，由于去勢的目的是消除雄激素作用，因此對MAGE-A2表達與雄激素之間關系進行探討，使用含雄激素的培養(yǎng)液培養(yǎng)前列腺癌細胞株LNCaP，結果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)培養(yǎng)的LNCaP細胞相比，前者細胞中MAGE-A2表達未改變，這顯示這雄激素并未涉及MAGE-A2 表達［26］。

6 小結

MAGE-A2的特異性表達模式，使其成為腫瘤免疫治療的理想靶抗原。MAGE-A2引發(fā)的主要是細胞免疫，在MAGE-A2蛋白分子中，目前已知3個MHC I類分子限制性表位及1個MHC II類分子限制性表位。MAGE-A2聯(lián)合其他黑色素瘤相關抗原制備多重黑素瘤相關抗原負載的DC疫苗在黑色素瘤轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)可誘導免疫反應，患者體內(nèi)腫瘤病灶及轉(zhuǎn)移灶尺寸明顯減小，顯示出復合疫苗強大的抗腫瘤免疫反應。MAGE-A2的表達與其啟動子區(qū)域的甲基化及組蛋白乙酰化酶的活性有關，了解了這個表達機理，將有助于我們應用去甲基化藥物或組蛋白乙酰化酶上調(diào)MAGE-A2表達，使其更有效應用于腫瘤免疫治療。近年來的研究表明MAGEA2與腫瘤藥物耐藥性有關，其耐藥性產(chǎn)生是通過影響p53活性實現(xiàn)的。且MAGE-A2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中其重要作用。目前對其生物學功能研究較少，相信通過對MAGE-A2生物學功能的探討，將有助于我們認識腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。

1 Nishiyama T，Tachibana M，Horiguchi Y et al.Immunotherapy of bladder cancer using autologous dendritic cells pulsed with human lymphocyte antigen-A24-specific MAGE-3 peptide［J］.Clin Cancer Res，2001;7(1):23-31.

2 Maraskovsky E，Sj?lander S，Drane DP et al.NY-ESO-1 protein formulated in ISCOMATRIX adjuvant is a potent anticancer vaccine inducing both humoral and CD8+t-cell-mediated immunity and protection against NY-ESO-1+tumors［J］.Clin Cancer Res，2004;10(8):2879-2890.

3 De Smet C，Lurquin C，van der Bruggen P et al.Sequence and expression pattern of the human MAGE2 gene［J］.Immunogenetics，1994;39(2):121-129.

4 Zammatteo N，Lockman L，Brasseur F et al.DNA microarray to monitor the expression of MAGE-A genes［J］.Clin Chem，2002;48(1):25-34.

5 De Plaen E，Arden K，Traversari C et al.Structure，chromosomal localization，and expression of 12 genes of the MAGE family［J］.Immunogenetics，1994;40(5):360-369.

6 Müller-Richter U D，Dowejko A，Zhou W et al.Different expression of MAGE-A-antigens in foetal and adult keratinocyte cell lines［J］.Oral Oncol，2008;44(7):628-633.

7 Gjerstorff M F，Harkness L，Kassem M et al.Distinct GAGE and MAGE-A expression during early human development indicate specific roles in lineage differentiation［J］.Hum Reprod，2008;23(10):2194-2201.

8 Eichmüller S，Usener D，Jochim A et al.mRNA expression of tumorassociated antigens in melanoma tissues and cell lines［J］.Exp Dermatol，2002;11(4):292-301.

9 Basarab T，Picard J K，Simpson E et al.Melanoma antigen-encoding gene expression in melanocytic naevi and cutaneous malignant melanomas［J］.Br J Dermatol，1999;140(1):106-108.

10 Brasseur F，Rimoldi D，Liénard D et al.Expression of MAGE genes in primary and metastatic cutaneous melanoma［J］.Int J Cancer，1995;63(3):375-380.

11 Chen P W，Murray T G，Uno T et al.Expression of MAGE genes in ocular melanoma during progression from primary to metastatic disease［J］.Clin Exp Metastasis，1997;15(5):509-518.

12 Gibbs P，Hutchins A M，Dorian K T et al.MAGE-12 and MAGE-6 are frequently expressed in malignant melanoma［J］.Melanoma Res，2000;10(3):259-264.

13 Scarcella D L，Chow C W，Gonzales M F et al.Expression of MAGE and GAGE in high-grade brain tumors:a potential target for specific immunotherapy and diagnostic markers［J］.Clin Cancer Res，1999;5(2):335-341.

14 Jacobs J F，Grauer O M，Brasseur F et al.Selective cancer-germline gene expression in pediatric brain tumors［J］.J Neurooncol，2008;88(3):273-280.

15 Tahara K，Mori M，Sadanaga N et al.Expression of the MAGE gene family in human hepatocellular carcinoma［J］.Cancer，1999;85(6):1234-1240.

16 Suzuki K，Tsujitani S，Konishi I et al.Expression of MAGE genes and survival in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Int J Oncol，1999;15(6):1227-1232.

17 Groeper C，Gambazzi F，Zajac P et al.Cancer/testis antigen expression and specific cytotoxic T lymphocyte responses in non small cell lung cancer［J］.Int J Cancer，2007;120(2):337-343.

18 Yoshimatsu T，Yoshino I，Ohgami A et al.Expression of the melanoma antigen-encoding gene in human lung cancer［J］.J Surg Oncol，1998;67(2):126-129.

19 Yamada A，Kataoka A，Shichijo S et al.Expression of MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3/-6 and MAGE-4a/-4b genes in ovarian tumors［J］.Int J Cancer，1995;64(6):388-393.

20 Zou C，Shen J，Tang Q et al.Cancer-testis antigens expressed in osteosarcoma identified by gene microarray correlate with a poor patient prognosis［J］.Cancer，2012;118(7):1845-1855.

21 Müller-Richter U D，Dowejko A，Reuther T et al.Analysis of expression profiles of MAGE-A antigens in oral squamous cell carcinoma cell lines［J］.Head Face Med，2009;5:10.

22 Abdul-Rasool S，Kidson S H，Panieri E et al.An evaluation of molecular markers for improved detection of breast cancer metastases in sentinel nodes［J］.J Clin Pathol，2006;59(3):289-297.

23 Shawler D L，Bartholomew R M，Garrett M A et al.Antigenic and immunologic characterization of an allogeneic colon carcinoma vaccine［J］.Clin Exp Immunol，2002;129(1):99-106.

24 Kim Y M，Lee Y H，Shin S H et al.Expression of MAGE-1，-2，and-3 genes in gastric carcinomas and cancer cell lines derived from Korean patients［J］.J Korean Med Sci，2001;16(1):62-68.

25 Wroblewski J M，Bixby D L，Borowski C et al.Characterization of human non-small cell lung cancer(NSCLC)cell lines for expression of MHC，co-stimulatory molecules and tumor-associated antigens［J］.Lung Cancer，2001;33(2-3):181-194.

26 Lifantseva N，Koltsova A，Krylova T et al.Expression patterns of cancer-testis antigens in human embryonic stem cells and their cell derivatives indicate lineage tracks［J］.Stem Cells Int，2011;2011:795239.

27 Kayser S，Watermann I，Rentzsch C et al.Tumor-associated antigen profiling in breast and ovarian cancer:mRNA，protein or T cell recognition?［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2003;129(7):397-409.

28 Suyama T，Shiraishi T，Zeng Y et al.Expression of cancer/testis antigens in prostate cancer is associated with disease progression［J］.Prostate，2010;70(16):1778-1787.

29 Goodyear O C，Pratt G，McLarnon A et al.Differential pattern of CD4+and CD8+T-cell immunity to MAGE-A1/A2/A3 in patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance(MGUS)and multiple myeloma［J］.Blood，2008;112(8):3362-3372.

30 Kawashima I，Hudson S J，Tsai V et al.The multi-epitope approach for immunotherapy for cancer:identification of several CTL epitopes from various tumor-associated antigens expressed on solid epithelial tumors［J］.Hum Immunol，1998;59(1):1-14.

31 Tahara K，Takesako K，Sette A et al.Identification of a MAGE-2-encoded human leukocyte antigen-A24-binding synthetic peptide that induces specific antitumor cytotoxic T lymphocytes［J］.Clin Cancer Res，1999;5(8):2236-2241.

32 Tanzarella S，Russo V，Lionello I et al.Identification of a promiscuous T-cell epitope encoded by multiple members of the MAGE family［J］.Cancer Res，1999;59(11):2668-2674.

33 Breckpot K，Heirman C，De Greef C et al.Identification of new antigenic peptide presented by HLA-Cw7 and encoded by several MAGE genes using dendritic cells transduced with lentiviruses［J］.J Immunol，2004;172(4):2232-2237.

34 Chaux P，Vantomme V，Stroobant V et al.Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+)T lymphocytes［J］.J Exp Med，1999;189(5):767-778.

35 Akiyama Y，Tanosaki R，Inoue N et al.Clinical response in Japanese metastatic melanoma patients treated with peptide cocktailpulsed dendritic cells［J］.J Transl Med，2005;3(1):4.

36 Shichijo S，Yamada A，Sagawa K et al.Induction of MAGE genes in lymphoid cells by the demethylating agent 5-aza-2＇-deoxycytidine［J］.Jpn J Cancer Res，1996;87(7):751-756.

37 Sigalotti L，Coral S，Nardi G et al.Promoter methylation controls the expression of MAGE2，3 and 4 genes in human cutaneous melanoma［J］.J Immunother，2002;25(1):16-26.

38 Wischnewski F，Pantel K，Schwarzenbach H.Promoter demethylation and histone acetylation mediate gene expression of MAGE-A1，-A2，-A3，and-A12 in human cancer cells［J］.Mol Cancer Res，2006;4(5):339-349.

39 Adair S J，Hogan K T.Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2＇-deoxycytidine upregulates the expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibility complex-encoded molecules［J］.Cancer Immunol Immunother，2009;58(4):589-601.

40 Wischnewski F，F(xiàn)riese O，Pantel K et al.Methyl-CpG binding domain proteins and their involvement in the regulation of the MAGEA1，MAGE-A2，MAGE-A3，and MAGE-A12 gene promoters［J］.Mol Cancer Res，2007;5(7):749-759.

41 Duan Z，Duan Y，Lamendola D E et al.Overexpression of MAGE/GAGE genes in paclitaxel/doxorubicin-resistant human cancer cell lines［J］.Clin Cancer Res，2003;9(7):2778-2785.

42 Monte M，Simonatto M，Peche L Y et al.MAGE-A tumor antigens target p53 transactivation function through histone deacetylase recruitment and confer resistance to chemotherapeutic agents［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(30):11160-11165.