高血糖對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及細胞色素C表達的影響

林冬融 韓江全 胡泳濤 (遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院神經內科，廣東 珠海 519100)

研究表明，高血糖是非糖尿病急性卒中患者高發病率和高死亡率的重要獨立危險因素，同時也可能是導致局部或廣泛缺血后預后更差的危險因素〔1～3〕。細胞色素C(Cyt-C)作為一個普遍的線粒體起源的細胞死亡信號〔4〕，在細胞凋亡過程中起著重要的作用。但高血糖是否影響線粒體的凋亡相關途徑，目前尚未明了。本實驗檢測高血糖條件下大鼠腦缺血再灌注損傷的神經功能評分及Cyt-C的表達，探討高血糖加重腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠70只(遵義醫學院珠海校區中心實驗室提供)，8～9周齡，體重250～300 g，隨機分為三大組:高血糖組30只、正常血糖組30只、假手術組10只。前兩組再隨機按腦缺血2 h再灌注后6、12、24 h分為三個亞組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 高血糖大鼠模型的制備 大鼠實驗前禁食12 h，自由進水。高血糖組于造模前30 min尾靜脈注射25%葡萄糖4 g/kg，造成高血糖狀態。正常血糖組則以同樣方法注射等量18%D-甘露醇。用血糖儀在栓線前測定血糖值。

1.2.2 腦缺血再灌注模型的制備 實驗大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，采用改良Longa線栓法建立大腦中動脈阻塞再灌注模型。所有實驗大鼠均栓塞右側大腦中動脈(MCA)。栓塞2 h拔出栓線，分別于再灌注后6、12、24 h(每個亞組10只)處死。假手術組僅做頸部正中切口，暴露右側頸總動脈，縫合皮膚。模型成功的標志是動物蘇醒后出現同側的Horner征(眼裂變小，眼球內陷)和對側以前肢為重的偏癱。

1.2.3 神經功能評分 參照Zea-Longa5級4分制評分標準，分別于各時間點對實驗大鼠進行神經功能評分:0分:無神經功能缺失癥狀;1分:輕度局灶性神經功能缺失(大鼠被提尾懸空時病灶對側前肢呈屈曲、抬高、肩內收、肘關節伸直);2分:中度局灶性神經功能缺失(有向癱瘓側旋轉征象);3分:重度局灶性神經功能缺失(有向病灶對側跌倒征象);4分:無自發活動及意識水平下降。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法，嚴格按照試劑盒(武漢博士德公司)說明書進行。顯微鏡下在缺血半暗帶區取5個高倍視野，計算陽性細胞數(鏡下細胞核內有棕黃色顆粒)。

1.2.5 免疫組化檢測Cyt-C表達 采用SABC法。石蠟切片常規脫蠟至水后進行擴原修復。阻斷內源性過氧化物酶的活性，滴加正常非免疫動物血清封閉。抗體稀釋液1∶100稀釋Ⅰ抗(Cytochrome C Rabbit mAb，購自武漢博士德生物工程有限公司)。滴加Ⅰ抗，4℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，移去Ⅰ抗，以0.01 mol/L PBS沖洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG，室溫孵育10 min，PBS洗。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS洗。DAB顯色，蘇木素復染，返藍。脫水透明封片，顯微鏡觀察，陽性細胞胞質呈棕黃色。在每張切片皮質區隨機取不相重復的5個視野，數碼相機拍照，MiVnT顯微生物圖像分析系統對所拍圖象進行分析，統一光飽和度、亮度和色調，取平均灰度級算術均數用于各組間比較。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS17.0軟件分析系統處理，以±s表示，采用單因素方差分析檢驗。

2 結果

2.1 造模前血糖值 高血糖組血糖(16.48±1.88)mmol/L水平明顯高于正常血糖組(5.91±0.34)mmol/L(P＜0.01)。

2.2 神經功能評分 假手術組全部動物均為0分，未見神經功能缺損;其余兩組在大鼠麻醉清醒后即出現不同程度的神經功能缺損。正常血糖缺血再灌注組與假手術組比較，神經功能缺損程度明顯加重(P＜0.01);高血糖組與正常血糖組比較，神經功能缺損加重(P＜0.05)。見表1。

2.3 TUNEL染色及光鏡下凋亡細胞計數 光鏡下假手術組可見少量凋亡細胞(0.50±0.53，細胞核內可見棕黃色顆粒)。正常血糖組再灌注6 h可見凋亡細胞，12 h逐漸增高，于再灌注24 h達高峰。高血糖組于再灌注6、12、24 h凋亡細胞計數多于相同時間段內正常血糖組(P＜0.05)。見表2，圖1。

2.4 Cyt-C免疫組織化學染色 假手術組未見Cyt-C表達(151.33±3.22);正常血糖組再灌注6 h可見Cyt-C表達，12 h逐漸增高，于再灌注24 h達高峰;高血糖組于再灌注6、12、24 h Cyt-C表達明顯高于正常血糖組相應各亞組。見表3，圖2。

表1 神經功能評分比較(±s，n=10)

表1 神經功能評分比較(±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與相同時間點正常血糖組比較:2)P＜0.01，3)P ＜0.05，下表同

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 1.40±0.521) 2.20±0.631)2)再灌注12 h 2.60±0.521) 3.50±0.711)2)再灌注24 h 3.30±0.481) 3.80±0.421)2)

表2 凋亡細胞計數比較(±s，n=10)

表2 凋亡細胞計數比較(±s，n=10)

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 11.40±1.511) 12.80±1.141)3)再灌注12 h 15.40±1351) 18.80±1.481)2)再灌注24 h 17.50±1.081) 19.10±0.991)2)

表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s，n=10)

表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s，n=10)

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 117.40±1.501) 114.30±1.341)2)再灌注12 h 115.30±1.641) 109.00±1.561)2)再灌注24 h 113.10±1.521) 106.70±1.771)2)

圖2 各組腦缺血半暗帶皮質區Cyt-C免疫組織化學染色(IHC，×400)

3 討論

腦缺血的發病機制，涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥介質釋放、自由基損傷、細胞內Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用等。近年來研究〔5，6〕表明，神經細胞凋亡在腦缺血神經細胞損害中發揮重要作用。急性缺血性腦損傷發生后，梗死的周邊部位即半暗帶區的神經元損傷主要通過凋亡途徑進行，凋亡神經元的多少決定著缺血引起的損害最終范圍大小，細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要環節，而線粒體則是細胞凋亡過程中重要的細胞器〔7〕。線粒體是通過向胞漿釋放Cyt-C等途徑參與各種凋亡過程，尤其是Cyt-C從線粒體向細胞漿的重新分布，這與各因素誘導凋亡產生有密切的關系。

高血糖既是缺血性腦血管病的危險因素之一，也是缺血區神經元損傷加重的因素。高血糖加重腦缺血損傷的機制是多途徑、多水平的，包括有高血糖缺血腦組織中乳酸聚集，加重細胞內酸中毒，對缺血部位神經元產生直接毒性;高血糖促進興奮性氨基酸堆積;高血糖增強一氧化氮(NO)毒性作用;高血糖破壞血腦屏障，并促進梗死出血等，血管損傷和乳酸堆積酸中毒是最基本的途徑。本實驗結果顯示，Cyt-C的表達強度與凋亡細胞的數目存在一定關系。Cyt-C是一種可溶蛋白，正常時位于線粒體膜內并松散地附著于線粒體膜的內表面，當Cyt-C從細胞線粒體轉移到胞質，則可通過免疫組織化學方法檢測到。釋放到細胞質中的Cyt-C通過結合凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9后，再激活caspase-3，這是導致細胞凋亡產生的中心事件〔8〕。以上結果表明通過線粒體通路加重細胞凋亡過程，是高血糖加重腦缺血損傷的機制之一。

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4 Kelvin Cain，Bratton SB，Cohen GM.The Apaf-1 apoptosome:a large caspase-activating complex〔J〕.Biochimie，2002;9(2-3):203.

5 韓江全，李 均，李官成，等.葛根素對大鼠缺血側皮質、紋狀體區神經元凋亡及膠質細胞源性神經生長因子的影響〔J〕.第三軍醫大學學報，2009;31(19):1912-3.

6 Nijboer CH，Heijnen CJ，Groenendaal F，et al.A dual Role of the NF-{kappa}B pathway in neonatal hypoxic ischemic brain damage〔J〕.Stroke，2008;39(9):2578-86.

7 Hong SJ，Dawson TM，Dawson VL.Nuclear and mitochondral conversations in cell death:PARP-l and AIF signaling〔J〕.J Trends Pharmacol Sci，2004;25(5):259-64.

8 Suzuki A，Tsutomi Y，Yamamato N，et al.Mitochondrial regulation of cell death:mitochondria are essential for procase-3 p21 complex formation to resist Fas mediated cell death〔J〕.Mol Cell Biol，1999;19(9):3842.