人參二醇皂甙對內(nèi)毒素休克大鼠腎組織CD14和IL－18表達的影響

鄢春亭 陳奕名 韓 笑 (吉化集團公司總醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 吉林 3202)

內(nèi)毒素休克所致的腎功能障礙是臨床常見的危重急癥，其中70%的病人需要腎臟替代治療，死亡率仍居高不下〔1〕。脂多糖內(nèi)毒素(LPS)可通過激活一系列信號傳導途徑，刺激機體免疫細胞釋放大量細胞因子及自由基，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應〔2〕。此過程中，腎臟是受累的重要器官，單核細胞(CD14)即LPS受體是通常選擇的關鍵蛋白，在LPS信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用。本實驗擬探討CD14與白細胞介素-18(IL-18)在內(nèi)毒素休克大鼠腎組織中的變化以及人參二醇皂苷(PDS)對其影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PDS(吉林大學天然藥物研究室提供);大腸埃希桿菌內(nèi)毒素(LPS，E.Coli 0111:B4)，購于 Sigma公司;CD14多克隆抗體(BA0719)，IL-18多克隆抗體(BA1215)購于博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 30只成齡Wistar大鼠，吉林大學醫(yī)學動物繁育中心提供。雌雄不拘，體重(250±10)g，隨機分為空白對照組(CTR)，LPS模型組(LPS)，人參二醇皂苷預防治療組(PDS)。

1.2.2 模型建立及組織留取 Wistar大鼠實驗前禁食過夜，自由攝水。實驗當天用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠板上。手術分離一側(cè)股動脈并插管，與壓力傳感器相連，記錄基礎血壓。舌下靜脈注射 LPS(5 mg/kg)，平均血壓下降至實驗前基礎血壓的2/3時判定為休克狀態(tài)，記錄休克前后不同時間點動脈血壓的動態(tài)變化。實驗前CTR組和LPS組靜脈注射5%葡萄糖溶液(5 ml/kg);PDS組用人參二醇皂苷(20 mg/kg)，均以等容量的5%葡萄糖配制靜脈注射。10 min后除CTR組外，均經(jīng)舌下靜脈注射5%葡萄糖稀釋的LPS(5 mg/kg)，CTR組靜脈注射等容量的5%葡萄糖溶液。于休克240 min時處死動物。取腎臟置液氮中速凍，后轉(zhuǎn)為－70℃保存，用于蛋白質(zhì)的研究。另取腎臟組織置10%中性甲醛中固定16 h，石蠟包埋，切片，用于形態(tài)學研究。

1.2.3 腎臟組織免疫組織化學 應用鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組織化學染色法，常規(guī)方法處理玻片后用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常兔血清滴于組織片上封閉非特異蛋白，加兔抗鼠CD14多克隆抗體(1∶500稀釋濃縮型抗體)，后滴加生物素化的兔抗鼠IgG，顯微鏡下觀察組織中CD14表達，照相。

1.2.4 CD14和IL-18蛋白表達

1.2.4.1 腎臟組織蛋白的提取 參照《分子克隆學》提供的方法提取腎組織總蛋白和膜蛋白，并以Bio-rad蛋白檢測試劑盒測定提取蛋白的濃度。

1.2.4.2 Westren印跡 取蛋白15 μg，加蛋白上樣緩沖液，加10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉過夜。分別以CD14，IL-18進行免疫印跡雜交(兔抗大鼠CD14多克隆一抗?jié)舛葹?∶500稀釋，兔抗大鼠IL-18多克隆一抗?jié)舛葹?∶300稀釋)，室溫與膜孵育120 min，洗膜后加入1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG二抗。室溫孵育60 min。然后溶于過硫酸銨(AP)緩沖液的堿性磷酸酶底物顯色試劑盒(NBT-BCIP)顯色液顯色。特異性條帶的光密度值采用上海天能科技有限公司GIS圖像分析系統(tǒng)處理。陰性對照膜用未免疫的兔血清1∶200稀釋，代替一抗，其他過程同上。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織CD14免疫組化結(jié)果 LPS組的腎臟組織CD14蛋白呈陽性表達，而PDS組CD14蛋白表達水平與LPS組相比明顯降低。見圖1。

2.2 腎臟組織CD14的表達 Westem印跡掃描分析腎臟組織LPS組的腎臟組織CD14蛋白表達水平最高，而PDS組CD14蛋白表達水平與LPS組相比明顯降低。見圖2，表1。

圖1 CD14在內(nèi)毒素休克大鼠腎臟的表達(×40)

表1 各組腎臟組織中CD14和IL-18蛋白相對含量(±s，n=3)

表1 各組腎臟組織中CD14和IL-18蛋白相對含量(±s，n=3)

與CTP組比較:1)P＜0.05;與LPS組比較:2)P＜0.05

組別 CD14蛋白 IL-18蛋白CTR組0.280 5±0.003 7 0.207 7±0.006 2 LPS組 0.924 1±0.028 01) 4.142 4±0.051 81)PDS組 0.620 7±0.004 42) 1.319 0±0.010 92)

圖2 Western印跡分析各組腎臟中CD14的表達

2.3 腎臟組織IL-18蛋白的表達 Westem印跡掃描分析腎臟組織，與CTR組相比，LPS組IL-18蛋白表達水平明顯增高;與LPS組相比，PDS組IL-18蛋白表達水平明顯減少。見表1，圖3。

圖3 Western印跡分析各組腎臟中IL-18的表達

3 討論

內(nèi)毒素休克以全身性低血壓和多臟器衰竭為主要臨床特征，導致的腎功能障礙是臨床常見的危重急癥。全身炎癥反應綜合征是引起多器官功能障礙的重要原因，而炎細胞的持續(xù)活化與播散，活化炎細胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)的失去自限性，通過自我無限放大的級聯(lián)反應，炎癥介質(zhì)過多產(chǎn)生與釋放，引起細胞乃至臟器損傷，嚴重者導致多臟器衰竭，成為內(nèi)毒素休克死亡的重要原因。目前研究已經(jīng)證明，LPS受體介導的信號轉(zhuǎn)導通路被激活是導致炎癥細胞活化及促炎因子大量釋放的關鍵。LPS首先與LPS的結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，再傳遞給膜受體CD14，形成LPS-LBP-CD14復合物〔3〕，該復合物與跨膜受體TLR-MD2相互作用，通過激活細胞內(nèi)的信號傳導通路而最終導致核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活化入核，引起多種炎癥因子(TNF-α，IL-6，IL-18等)的合成與釋放〔4～6〕。

腎小球系膜細胞(MCs)是腎小球內(nèi)非常活躍的固有細胞，在內(nèi)毒素休克腎臟損傷中既是靶細胞，又是參與者。腎小管上皮細胞(TECs)是腎臟的另一重要細胞，具有抗原遞呈功能，并可通過自分泌和旁分泌方式分泌多種炎癥因子參與腎小管的炎癥形成〔7〕。研究表明，MCs表面可表達膜 CD14分子(mCD14)。mCD14在人類和多種動物的單核細胞上大量表達，粒細胞上少量表達，在多數(shù)組織巨噬細胞也有表達，它們統(tǒng)稱為CD14陽性細胞。典型的CD14陽性細胞對LPS的反應模式為:LPS先與LBP形成復合物，再與mCD14結(jié)合，然后引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及細胞效應的產(chǎn)生〔8，9〕。而 TECs不能表達mCD14，可由LPS直接刺激，與sCD14結(jié)合，產(chǎn)生活性氧自由基及炎癥細胞因子。

本實驗結(jié)果顯示，LPS組大鼠腎臟組織CD14，IL-18蛋白表達明顯高于對照組，而PDS組能顯著降低其表達。由此可見，PDS可阻斷LPS與受體結(jié)合向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導信號，從而在LPS信號傳導通路的上游發(fā)揮作用，避免了繼續(xù)的過度反應，減少了NF-κB的入核，使各種炎癥因子的表達量減少。

PDS為人參總甙中水溶性部分，是人參重要活性成分，有廣泛的藥理作用。本研究室對PDS從事多年研究表明，PDS具有降血脂、抗血小板聚積、抗心肌缺血、提高身體免疫力、預防感染等作用，PDS對內(nèi)毒素休克大鼠肝臟及肺臟有明顯的保護作用〔10，11〕。本研究結(jié)果表明:PDS抑制CD14的表達，從而抑制IL-18等炎癥因子的釋放，是實現(xiàn)對腎臟保護作用的重要機制。

1 Bagshaw SM，George C，Bellomo R.Changes in the incidence and outcome for early acute kidney injury in a cohort of Australian intensive care units〔J〕.Crit Care，2007;11(3):R68.

2 Watters JM，Tieu BH，Todd SR，et al.Fluid resuscitation increases inflammatory gene transcription after traumatic injury〔J〕.J Trauma，2006;61(2):300-8.

3 Cowan DB，Poutias DN，Del Nido PJ，et al.CD14-independent activation of cardiomyocyte signal transduction by bacterial endotoxin〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000;279(2):H619-29.

4 Chandrasekar B，Valente AJ，F(xiàn)reeman GL，et al.Interleukin-18 induces human cardiac endothelial cell death via a novel signaling pathway involving NF-kappaB-dependent PTEN activation〔J〕.Bioch Bioph Res Commun，2006;339(3):956-63.

5 付金鵬，尤勝義.IL-18與膿毒癥免疫功能紊亂〔J〕.國際外科學雜志，2007;34(8):550-2.

6 Orange JS，Geha RS.Finding NEMO:genetic disorders of NF-κB activation〔J〕.J Clin Invest，2003;112(7):983-5.

7 Tetta C，Cavaillon JM，Camussi G，et al.Continuous plasma filtration coupled with sorbents〔J〕.Kidney Int，1998;53(suppl 66):186-9.

8 Fanous MY，Phillips AJ，Windsor JA.Mesenteric lymph:the bridge to future management of critical illness〔J〕.J Pancreas，2007;8(4):374-99.

9 Kim JI，Lee CJ，Jin MS，et al.Crystal structure of CD14 and its implications for lipopolysaccharide signaling〔J〕.J Biol Chem，2005;280(12):11347-51.

10 于振香，彭麗萍，左夢華，等.人參二醇皂甙對“兩次打擊”全身炎癥反應綜合征大鼠肺CD14和NF-kB表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(3):208-10.

11 李 璐，劉喜春，于振香，等.人參二醇皂甙對內(nèi)毒素休克大鼠肺CD14和NF-kB表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2005;31(2):231-5.