柴胡皂苷對酒精性肝病大鼠肝臟再生增強因子表達的影響

戈宏焱 陳 博 劉會龍 (內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

酒精性肝病(ALD)包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、肝硬化，是指由于乙醇(酒精)攝入過多導(dǎo)致的肝臟損壞及其一系列病變〔1〕。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，ALD的發(fā)病率也逐年增加，因此對于該病的治療及發(fā)病機制的研究也日益受到重視。最新研究發(fā)現(xiàn)部分應(yīng)用于臨床的保肝類藥物均與肝臟中肝再生增強因子(ALR)表達關(guān)系密切。本實驗觀察柴胡皂苷對ALD大鼠肝臟ALR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗器材及材料 Wistar大鼠60只，體重180～220 g，由吉林大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供;牛欄山二鍋頭56°;柴胡皂苷(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院制備)，梯度PCR儀(德國Biometra公司);7550型紫外分光光度計 (上海惠普公司);DYY-Ⅲ4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);超速低溫離心機(德國貝克曼公司);PP-200S型電子天平(上海華威電子儀器廠);水平式電泳槽(北京六一儀器廠);紫外透射檢測儀(上海雙贏科學(xué)儀器廠);Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)(EDAS);多功能顯微鏡(日本奧林帕斯公司MDI);RT-PCR兩步法試劑盒、Trizol(日本Takara公司)。

1.2 所需引物及基因序列 特異引物由大連寶生物科技有限公司合成，β-actin 218上游:5'-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3';下游:5'-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3';ALR上游:5'-ACGGATCCA GCGGACCCAGCAG-3';下游:5'-CGGAATTCTTAGTCACAGGAGC-3'。擴增片段長度218 bp、378 bp。引物設(shè)計根據(jù)Primer4.0設(shè)計軟件完成。

1.3 實驗分組及取材制片 60只大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機分為5組，每組12只。正常組:按照需要正常給予飼料及飲水，每日生理鹽水灌胃10 ml/kg。ALD組:參照文獻〔2〕，加以改進后建立模型，56%酒精灌胃10 ml·kg－1·d－1，持續(xù)8 w。柴胡皂苷組在4 w后每日按10 ml/kg飼養(yǎng)環(huán)境及給藥方式同酒精性肝病組至實驗結(jié)束。分別于術(shù)后3、5、7 d處死大鼠切除肝臟，每組每天6只大鼠，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗沖去血液后，于液氮中凍存。

1.4 實驗方法

1.4.1 提取大鼠肝臟總RNA 剪取大鼠肝臟約100 mg置于預(yù)冷的玻璃勻漿器，立即加入適量RNAiso Plus充分勻漿(盡量保持低溫)，室溫放置5 min，加入200 μl氯仿，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，將上清液小心移入另一離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入75%乙醇約1 000 μl，靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，倒置于濾紙上，室溫放置5～10 min，使乙醇揮發(fā)，20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀，－80℃凍存。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按下列組成配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:MgCl22 μl;10 × RT Buffer 1 μl;RNase Free H2O 3.75 μl;dNTP Mixture(各 10 mmol/L)1 μl;RNase Inhibitor 0.25 μl;AMV Reverse Transcriptase1 0.5 μl;Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl;實驗樣品 RNA 1 μl，按照以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。30℃ 10 min;48℃ 30 min;99℃ 5 min;5℃ 5 min;1個循環(huán)。

1.4.3 PCR反應(yīng)及鑒定 按下列組成配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。5 × PCR Buffer 10 μl，滅菌蒸餾水 28.75 μl，dNTP(10 mmol/L)2 μl，上、下游引物各0.5 μl(包括 β-actin218 和 ALR 的上、下游引物)，mRNA 模板 1 μl，Takara Ex Taq HS 0.25 μl，把上述反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，在PCR儀上進行循環(huán)擴增:94℃ 4 min 1個循環(huán);94℃ 45 s;50℃45 s;72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃10 min。取20 μl PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，0.5%溴乙錠染色20 min。在紫外線燈下觀察實驗結(jié)果，用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)(EDAS)進行分析，分別計算每一條泳道的目地基因擴增產(chǎn)物與內(nèi)參β-actin218擴增產(chǎn)物的強度比值，表示該目的基因的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件行t檢驗。

2 結(jié)果

與正常組相比，ALD組大鼠肝臟ALR mRNA表達顯著升高(P＜0.05);柴胡皂苷組、酒精戒斷組大鼠治療后好轉(zhuǎn)，肝臟ALR mRNA表達與正常對照組相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組ALR mRNA表達

3 討論

近年來，我國ALD有明顯增多的趨勢，已成為僅次于病毒性肝病的第二大肝病治病因素，當ALD發(fā)展到肝纖維化階段時，尚無特效治療方法及藥物逆轉(zhuǎn)這一進程，支持治療作用有限。因此，闡明ALD的發(fā)病機制，尋找能有效預(yù)防和治療ALD的藥物尤為迫切。柴胡是內(nèi)蒙古地區(qū)較常見的植物類藥物，被蒙醫(yī)及中醫(yī)廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的治療中，并且效果顯著，療效確切。臨床研究顯示柴胡具有肝臟保護作用，柴胡皂苷是柴胡的主要成分。ALR是目前已知唯一對肝源性細胞有特異性增殖刺激活性的因子，定位于16號染色體的P13.31～P13.32，該基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子〔3，4〕。最新研究發(fā)現(xiàn)部分應(yīng)用于臨床的保肝類藥物均與ALR關(guān)系密切。本實驗結(jié)果表明柴胡皂苷組大鼠ALR的表達下調(diào)。ALD的治療原則是:戒酒和營養(yǎng)支持，減輕ALD的嚴重程度〔5～8〕。本實驗進一步證實了柴胡皂甙通過以上機制保護肝臟的確切性。

1 戈宏焱，陳 博.柴胡皂苷對大鼠酒精性肝損害保護作用的實驗研究〔J〕. 臨床肝膽病雜志，2012;28(12):945-7.

2 張羹之，張 瑜，李琳琳.葫蘆巴總皂普對大鼠酒精性脂肪肝的治療作用〔J〕.中華肝臟病雜志，2006;14(11):854-6.

3 Lisowsky T，Lee JE，Polimeno L，et al.Mammalian augment of live regeneration protein is a sulfhydryl oxidase〔J〕.Dig Liver Dis，2001;33(2):173-80.

4 Tilg H，Day CP.Management strategies in alcoholic liver disease〔J〕.Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol，2007;4(1):24-34.

5 Barve A，Khan R，Marsano L，et al.Treatment of alcoholic liver disease〔J〕.Ann Hepatol，2008;7(1):5-15.

6 O'Shea RS，Dasarathy S，McCullough AJ，et al.Alcoholic liver disease〔J〕.Hepatology，2010;51(1):307-28.

7 Stickel F，Hoehn B，Schuppan D，et al.Review article:nutritional therapy in alcoholic liver disease〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2003;18(4):357-73.

8 Mathurin P，Mendenhall CL，Carithers RL Jr，et al.Corticosteroids improve short-term survival in patients with severe alcoholic hepatitis(AH):individual data analysis of the last three randomized placebo controlled double blind trials of corticosteroids in severe AH〔J〕.J Hepatol，2002;36(4):480-7.