水飛薊素對腎小管間質纖維化大鼠中生長因子-β1表達的影響

王成祥 韓子明

腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病發展的最終結局，是導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一［1］。這個過程受許多因素影響，其發展機制涉及許多方面。近年來研究表明轉化生長因子-β1(TGF-β1)在TIF進程中具有重要的促進作用［2］。本文旨在探討應用水飛薊素延緩腎小管間質纖維化可能機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型及分組 選用3月齡SD大鼠56只，體重200～250 g，隨機分為:梗阻組(24只)、治療組(24只)、假手術組(8只)。大鼠行氯胺酮50 mg/kg麻醉，取左旁正中切口剪開腹壁，以4號手術線將左輸尿管近端兩處結扎。假手術組同樣處理但不結扎。其中于術前30 min治療組開始給予水飛薊素30 mg/kg灌胃，1次/d;假手術組和梗阻組給予等量生理鹽水灌胃處理。UUO大鼠于術后第7天、14 d、21 d隨機收獲8只，假手術組于第21天一次處死。取腎臟，10%多聚甲醛固定。免疫組織化學法檢測腎臟TGF-β1的表達情況和RTPCR法檢測各組腎組織TGF-β1mRNA表達水平。實驗過程中梗阻組第14天、21 d時間點各死亡大鼠1只。

1.2 免疫組化 采用SABC法檢測腎組織中的TGF-β1，操作步驟按SABC試劑盒說明書進行。高倍鏡(×200)下在每張不包含腎小球和血管的腎小管間質區域隨機選取10個不重疊的視野，應用IDA-2000高清晰度數碼圖像分析系統進行圖像采集，經灰度變換將陽性染色區域面積與該視野總面積百分比，計算平均值作為該樣本的百分比值。

1.3 RT-PCR PCR引物合成:上海申工生物工程公司。引物序列及產物如下。

引物 序列產物長度TGF-β1 引物5'TAA TGG TGG ACC GCA ACA ACG 3' 680bp 5'CTT GCT GTA CTG TGT GTC CAG 3'β-actin引物 5'CTT TTG TGC CTT GAT AGT TC 3' 265bp 5'GAG TCC TTC TGA CCC ATA C 3'

采用凝膠成像攝片及分析用瓊脂糖凝膠電泳圖像分析系統(SYNGENE公司)在紫外光下采集圖像并分析，分析時TGF-β1與β-actin擴增條帶的吸光度值比值作為各指標mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 腎組織免疫組化變化 假手術組腎組織微量表達TGF-β1，主要位于腎小球系膜和上皮細胞，小管主要表達于遠曲小管;梗阻組和治療組腎組織表達TGF-β1逐漸增強，遍布皮髄質損傷的腎小管，除腎小管上皮細胞有陽性表達外，增殖的單核巨噬細胞TGF-β1亦有表達。各觀察時間點治療組較梗阻組減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR結果 假手術組大鼠腎臟存在少量TGF-β1mRNA表達。UUO大鼠各組隨著病情進展，腎組織表達TGF-β1mRNA逐漸增強，高峰持續至21 d實驗結束。治療組腎臟組織表達TGF-β較梗阻組減少(P均＜0.05)，見圖1。各組在腎組織表達變化見表1。

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1及mRNA表達(±s)

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1及mRNA表達(±s)

注:★P＜0.05 compared with sham operated group;◆P＜0.05 compared with operated group

鼠數 TGF-β1 TGF-β1 mRNA假手術組21 d 8 0.21±0.08 0.28±0.04梗阻組 7 d 8 2.24±0.21★ 0.63±0.13★14 d 7 5.43±0.18★ 0.99±0.16★21 d 7 6.08±0.12★ 1.47±0.14★治療組 7 d 8 1.34±0.22★◆ 0.47±0.08★◆14 d 8 4.19±0.21★◆ 0.68±0.11★◆21 d 8 2.0846±0.2017★◆ 0.76±0.15★◆

圖1

3 討論

水飛薊素是從水飛薊植物提取的混合物，是一種黃酮醇類化合物，主要含水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊醇等。水飛薊素作為一種傳統藥物曾廣泛用于防治肝臟纖維化。它主要通過下調TGF-β1在肝內的表達，改變肝枯否細胞的功能，抑制炎癥反應，有效阻止肝纖維化［3］。韓子明等［4］應用水飛薊素治療大鼠腎小管間質纖維化，明顯延緩了腎小管間質纖維化。TGF-β1表達增加與腎間質纖維化關系密切。本實驗研究結果顯示:梗阻組、治療組腎組織表達TGF-β1逐漸增強，遍布皮髄質損傷的腎小管，除腎小管上皮細胞有陽性表達外，增殖的單核巨噬細胞TGF-β1亦有表達。RT-PCR結果顯示TGF-β1mRNA與蛋白表達水平在UUO大鼠術側腎臟漸進性增加的情況，反映了相似的分布變化規律。這與文獻報道相一致。經水飛薊素治療的治療組腎臟組織各觀察時間點TGF-β1mRNA與蛋白表達均較梗阻組減少(P＜0.05)。上述說明TGF-β1在腎小管間質纖維化中起著重要作用，水飛薊素通過下調TGF-β1的表達，延緩腎小管間質纖維化。但是，腎小管間質纖維化發病機制十分復雜，關于水飛薊素在緩解腎小管間質纖維化作用機制方面還有待進一步深入研究。

［1］Li M.X，Liu B.C.Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis.Chinese Medical Journal，2007，120，1925–1930.

［2］Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol.2008，214:199-210.

［3］Jeong DH，Lee GP，Jeong WI，et al.Alterations of mast cells and TGF-betal on the silymarin treatment for CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol，2005，11(8):1141-8.

［4］韓子明，趙德安，趙海霞.水飛薊素對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管間質纖維化的干預作用.實用兒科臨床雜志，2008，17:136-8.