牛磺酸對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的保護(hù)作用

任素芬 劉學(xué)政

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜光感受器和神經(jīng)元的功能以及維持血-視網(wǎng)膜屏障的完整性中具有重要作用［1］。視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激導(dǎo)致Müller細(xì)胞功能受損是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的重要機(jī)制之一［2］。研究表明，持續(xù)給予牛磺酸可抑制DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激［3］，但牛磺酸抑制DM視網(wǎng)膜應(yīng)激對(duì)Müller細(xì)胞的影響尚不完全清楚，因此本研究擬探討牛磺酸對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響及其機(jī)制，以期為DR的臨床防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 雄性SD大鼠，180～220 g(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，牛磺酸(北京嘉康源化工有限公司)，還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(碧云天生物公司)，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)抗體(Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠腹腔注射1%的STZ溶液(55 mg/kg，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解)，72 h后檢測(cè)尾靜脈血糖濃度＞16.7 mmol/L即為DM模型。牛磺酸溶于0.1 mol/L的PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組(正常SD大鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液)、DM組(STZ誘導(dǎo)的DM大鼠模型)、牛磺酸組(DM大鼠腹腔注射牛磺酸50 mg/kg，0.5 ml/d)，PBS組(DM大鼠腹腔注射0.1 mol/L的PBS)，3個(gè)月后進(jìn)行下列分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3 視網(wǎng)膜GSH和MDA含量的檢測(cè) 以10%的水合氯醛麻醉大鼠，剝離視網(wǎng)膜，以生理鹽水制成5%組織勻漿，4000 r/min離心取上清液，按試劑盒說明進(jìn)行操作，根據(jù)試劑盒提供公式計(jì)算GSH及MDA含量。

1.4 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜GFAP及GS蛋白表達(dá) 制備視網(wǎng)膜組織勻漿，12000 r/min離心15 min，取上清液 SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以GFAP、GS蛋白和β-actin一抗37℃孵育2 h后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，再以增強(qiáng)發(fā)光試劑盒顯影。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜GSH及MDA含量 與對(duì)照組相比，DM組及PBS組視網(wǎng)膜GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加(P＜0.05)，而牛磺酸組GSH及MDA含量均無明顯變化(P＞0.05)(表1)。

表1 大鼠視網(wǎng)膜MDA及GSH含量(x ± s，n=6/組)

2.2 牛磺酸對(duì)DM大鼠視網(wǎng)膜GFAP及GS表達(dá)的影響 以β-actin為內(nèi)對(duì)照，與對(duì)照組相比，DM組及PBS組GFAP表達(dá)上調(diào)，GS表達(dá)明顯下調(diào)，而牛磺酸組GFAP及GS表達(dá)均無明顯改變(圖1)。

圖1 Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜GFAP及GS表達(dá)變化

3 討論

Müller細(xì)胞占視網(wǎng)膜細(xì)胞總數(shù)的4% ～5%，約占視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞90%以上，貫穿于視網(wǎng)膜全層，與視網(wǎng)膜光感受器、神經(jīng)元、其他類型膠質(zhì)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜血管等具有緊密聯(lián)系，不僅在神經(jīng)元的營養(yǎng)及興奮性傳遞中也發(fā)揮重要作用，在維持細(xì)胞外環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管通透性以及血-視網(wǎng)膜屏障完整性中頁發(fā)揮重要作用［1］。

Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能異常是DR的重要原因之一，Müller細(xì)胞受損表現(xiàn)為GFAP表達(dá)上調(diào)［1］。Müller細(xì)胞主要位于內(nèi)核層，其突起布及內(nèi)界膜至外界膜的整個(gè)視網(wǎng)膜，形成廣泛的突觸聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，DM 3個(gè)月時(shí)大鼠視網(wǎng)膜GSH含量降低，MDA增加，出現(xiàn)了氧化應(yīng)激表現(xiàn)，而DM大鼠給予牛磺酸可明顯增加視網(wǎng)膜GSH含量，并降低視網(wǎng)膜MDA含量。結(jié)果提示牛磺酸可抑制DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，DM大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生氧化應(yīng)激的同時(shí)GFAP表達(dá)上調(diào)，牛磺酸抑制DM視網(wǎng)膜應(yīng)激的同時(shí)下調(diào)了GFAP表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激導(dǎo)致了Müller細(xì)胞受損，而牛磺酸通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)Müller細(xì)胞受損。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了視網(wǎng)膜GS的表達(dá)變化，以進(jìn)一步探討牛磺酸抑制氧化應(yīng)激對(duì)DM視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞功能的影響。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中唯一可以合成GS的細(xì)胞，GS可將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate-aspartate trans-porter，GLAST)逆濃度差由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至Müller細(xì)胞內(nèi)的谷氨基酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，消除谷氨酸堆積所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，以防視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)生退行性改變［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激時(shí)GS表達(dá)下調(diào)，而牛磺酸抑制DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激可上調(diào)GS表達(dá)。結(jié)果提示，牛磺酸可能通過上調(diào)GS在Müller細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了谷氨酸轉(zhuǎn)化，在消除谷氨酸堆積的細(xì)胞毒性、預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性變以及DR臨床治療中發(fā)揮積極作用。

本研究為牛磺酸防治DR提供了思路，但牛磺酸對(duì)DM大鼠Müller細(xì)胞GLAST的活性及功能的影響尚不完全清楚，在清除DM大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸的作用仍有待進(jìn)一步探討。

［1］ Grosche A，Pannicke T，Karl A，et al.Physiologic properties of Müller cells from human eyes affected with uveal melanoma.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(7):4170-4176．

［2］ 張強(qiáng)，左中夫，劉學(xué)政.姜黃素對(duì)高濃度葡萄糖培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞活力的影響.國際眼科雜志，2012，12(9):1636-1638．

［3］ Di Leo MA，Santini SA，Cercone S，et al.Chronic taurine supplementation ameliorates oxidative stress and Na+K+ATPase impairment in the retina of diabetic rats.Amino Acids，2002，23(4):401-406．

［4］ Ishikawa M，Yoshitomi T，Zorumski CF，et al.Downregulation of glutamine synthetase via GLAST suppression induces retinal axonal swelling in a rat ex vivo hydrostatic pressure model.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(9):6604-6616