藤茶抗氧化活性研究

歐賢紅，葉 勇 ，黃秋潔，劉華鋼，宋云飛

1瀘州醫(yī)學(xué)院，瀘州 646000;2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004;3廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021;4桂林萊茵生物科技股份有限公司博士后工作站，桂林 541100;5廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsis grossedntata(Hand-Mazz)W.T.Wang］的莖葉，該植物總黃酮含量豐富［1］。研究表明［2］，黃酮類(lèi)化合物的抗衰老、抗突變、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用都與其抗氧化活性有關(guān)。藤茶總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可清除氧自由基，并能預(yù)防性對(duì)抗超氧陰離子自由基引起的氧化性損傷［2，3］。藤茶黃酮類(lèi)化合物包括楊梅素、二氫楊梅素、福建茶素、楊梅黃素、楊梅苷等，其中二氫楊梅素含量較高［1］。據(jù)報(bào)道［3，4］，楊梅素和二氫楊梅素清除DPPH·的活性均強(qiáng)于蘆丁，其中二氫楊梅素的抗氧化活性還強(qiáng)于Vit C和常用的人工合成抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)。張曉元等［5］采用ESR和自旋捕集技術(shù)測(cè)定二氫楊梅素對(duì)·OH、和DPPH·的清除效果。結(jié)果表明，二氫楊梅素清除自由基的能力是＞DPPH·＞·OH。該研究結(jié)果與徐靜娟等［6］采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法、抗壞血酸-Cu2+-H2O2體系法和亞油酸體系法的研究結(jié)果一致。此外，二氫楊梅素對(duì)動(dòng)物油和植物油均有很強(qiáng)的抗氧化作用。而楊梅素?zé)o論對(duì)水溶性食品或脂溶性食品，均能發(fā)揮很好抗氧化作用，作用明顯強(qiáng)于合成抗氧化劑3，5-二叔丁基-4-羥基甲基苯(BHT)和蘆丁［7］。因此，二氫楊梅素和楊梅素可作為天然抗氧劑應(yīng)用于食品保藏。

以往研究楊梅素和二氫楊梅素的抗氧化活性大多采用紫外分光光度法［4，6，7］。對(duì)藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素在DPPH·、氧自由基()和羥自由基(·OH)體系中的抗氧化活性尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，為進(jìn)一步明確藤茶不同提取物藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素的抗氧化活性，本文采用酶標(biāo)儀法檢測(cè)了藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對(duì)·OH、O2-·和DPPH·的清除效果并，比較它們清除自由基的能力。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀(型號(hào)VersaMax)。

1.2 藥品與試劑

藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素(均為自制，含量分別為74%、90%、83%，以1%DMSO超聲溶解成適宜濃度備用;DPPH·樣品(Sigma公司);鄰苯三酚、硫酸亞鐵(FeSO4)、乙醇、鹽酸(HCl)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰二氮菲(均為分析純)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DPPH·體系

［8］，并稍作改進(jìn):取0.5 mL不同濃度樣品液于離心管中，加入0.5 mL 0.08 mg/mL的DPPH·溶液(準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg DPPH·，加60%乙醇溶解于小燒杯中，移至250 mL容量瓶，定容)，混勻，取200 μL置于96孔板中，共3孔，靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度Ai;同時(shí)測(cè)定0.5 mL DPPH·溶液與0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Ac;0.5 mL提取液與0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Aj。采用維生素C(Vit C)作為陽(yáng)性對(duì)照藥按照同法進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率:抑制率={1-(Ai-Aj)/Ac}×100%，抑制率越大，則表示該試樣的抗氧化活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 ·OH 體系［9］

取0.1 mL 7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液置于1 mL離心管中，加入0.2 mL 0.2 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻后加入 0.1 mL 7.5 mmoL/L 的FeSO4溶液，充分混勻后加入0.1 mL 0.1%H2O2溶液，然后加雙蒸水補(bǔ)足到1 mL，混勻，取200 μL置于96孔板中，共3孔，在37℃水浴下反應(yīng)1 h后，以536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A(損害)。同上法，不加入H2O2和樣品溶液測(cè)定A(未損害)。方法同2.1，分別加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL后加H2O2，測(cè)536 nm時(shí)的吸收值，即得 A樣。重復(fù)3次。采用等濃度的Vit C作為陽(yáng)性對(duì)照藥按照同法進(jìn)行測(cè)試。按下式計(jì)算·OH清除率:·OH清除率(S%)=(A樣-A損害)/(A未損害-A損害)×100%。

取 2.7 mL PBS(pH 8.2)，加0.2 mL 蒸餾水，鄰苯三酚0.1 mL。混勻，于25℃保溫，4 min后加入10 mol/L HCl一滴終止反應(yīng)。取200 μL置于96孔板中，共3孔，于325 nm處測(cè)吸光度A0。測(cè)定樣品清除能力時(shí)，取2.7 mL PBS，加0.2 mL 不同濃度的樣液，0.1 mL的鄰苯三酚，混勻于25℃保溫，4 min后加入10 mol/L HCl一滴終止反應(yīng)。于325 nm處測(cè)吸光度Aj。采用等濃度的Vit C作為陽(yáng)性對(duì)照藥按照同法進(jìn)行測(cè)試。清除率計(jì)算公式:S=［1-(Aj-Ai)/A0］×100%，Ai為樣液吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)DPPH·的清除活性

以水溶性抗氧化劑Vit C作對(duì)照，研究了藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對(duì)DPPH·的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對(duì)DPPH·具有很明顯的清除作用，三者的清除效果均比同濃度的Vit C效果好，且呈量效關(guān)系。由表1可以看出，藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素清除DPPH·的IC50值為均大于Vit C，其中楊梅素的IC50值比藤茶總黃酮、二氫楊梅素的小，提示楊梅素的清除DPPH·效果優(yōu)于藤茶總黃酮、二氫楊梅素。

圖1 藤茶不同提取物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.1 DPPH· scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.2 對(duì)·OH的清除活性

由圖2可知，在10～80 mg/L濃度范圍內(nèi)，藤茶各提取物的抗氧化活性大小為:楊梅素＞二氫楊梅素＞藤茶總黃酮＞Vit C。但在200～400 mg/L濃度范圍內(nèi)藤茶各提取物對(duì)·OH的清除活性弱于Vit C。

圖2 藤茶不同提取物對(duì)·OH的清除作用Fig.2 ·OH scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.3 對(duì) O2-· 的清除活性

如圖3和表1所示，藤茶不同提取物藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素清除的作用明顯強(qiáng)于Vit C，且二氫楊梅素的清除作用優(yōu)于藤茶總黃酮和楊梅素，其 IC50為3.88 ±0.99 mg/L。

圖3 藤茶不同提取物對(duì)·的清除作用Fig.3 ·scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

注:與Vit C比較，1)P ＜0.05;與藤茶總黃酮比較，2)P ＜0.05;與二氫楊梅素比較，3)P ＜0.05;“-”無(wú)法計(jì)算IC50Note:Compare with Vit C，1)P ＜0.05;Compare with total flavonoid，2)P＜0.05;Compare with dihydromyricetin，3)P ＜0.05;“ － ”IC50cannot be calculated

IC50(mg/L)樣品Samples 體系System藤茶總黃酮 Total flavonoid 3.32 ±0.181) 5.22 ±3.751)DPPH·體系DPPH·System O-·2楊梅素 Myricetin 2.91 ± 0.281，2，3)5.02 ±0.091，3)二氫楊梅素 Dihydromyricetin 3.76 ±0.081) 3.88 ±0.991)Vit C Control 5.63 ±1.15 －

4 討論

藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。藤茶總黃酮清除黃嘌呤(黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的的 IC50為 14.7 mg/L［3］。在 0.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，藤茶總黃酮的抗活性氧能力呈量效關(guān)系，70 mg/mL藤茶總黃酮的抗氧化能力超過(guò)維生素E和Vit C［2］。本文采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)得藤茶總黃酮清除的 IC50為(5.22 ±3.75)mg/L，在1.0 ～20.0mg/L 范圍內(nèi)，對(duì)的抑制率高于同等濃度的Vit C，并呈量效關(guān)系。此外，本文結(jié)果顯示藤茶總黃酮清除DPPH·的IC50為 (3.32±0.18)mg/L，在2.0 ～ 10.0 mg/L 范圍內(nèi)，對(duì) DPPH·的抑制率高于同等濃度的Vit C，并呈量效關(guān)系;在10 ～200.0 mg/L范圍內(nèi)，對(duì)·OH的抑制作用呈量效關(guān)系，其抑制率高于同等濃度的Vit C。據(jù)報(bào)道［3，4］，楊梅素和二氫楊梅素清除 DPPH·的 IC50值分別為 18.34、10.70 μg/mL，它們的抗氧化活性均強(qiáng)于陽(yáng)性藥蘆丁(IC50=31.32 μg/mL)，其中二氫楊梅素還強(qiáng)于Vit C和常用的人工合成抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)。但是，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得楊梅素和二氫楊梅素清除 DPPH·的 IC50值分別為(2.91 ±0.28)、(3.76 ±0.08)mg/L，它們的抗氧化活性均強(qiáng)于陽(yáng)性藥Vit C。張曉元等［5］采用ESR和自旋捕集技術(shù)測(cè)定二氫楊梅素對(duì)·OH、和DPPH·的清除效果。結(jié)果表明，二氫楊梅素清除、·OH 和 DPPH·的 IC50分別為 7.4、297.8 和 12.4 μg/mL，表明二氫楊梅素對(duì)的清除作用更強(qiáng)。該研究結(jié)果與徐靜娟等［6］采用NBT光化還原法、抗壞血酸-Cu2+-H2O2體系法和亞油酸體系法的研究結(jié)果一致(二氫楊梅素對(duì)不同自由基的清除能力是O2-·＞·OH＞脂過(guò)氧自由基ROO·)。為進(jìn)一步明確藤茶不同提取物藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素的抗氧化活性，我們采用酶標(biāo)儀檢測(cè)了藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對(duì)·OH、和DPPH·的清除效果并比較它們清除自由基的能力，結(jié)果二氫楊梅素對(duì)DPPH·和的清除作用強(qiáng)于·OH，楊梅素對(duì)不同自由基的清除能力是DPPH·＞＞·OH;不同藤茶提取物對(duì)清除能力是二氫楊梅素＞楊梅素＞藤茶總黃酮，對(duì)·OH清除能力是楊梅素＞二氫楊梅素＞藤茶總黃酮，對(duì)DPPH·清除能力是楊梅素＞藤茶總黃酮＞二氫楊梅素。是生成其它活性氧自由基的前體，清除就意味著能控制其它活性氧自由基的形成［10］，因此，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示楊梅素和二氫楊梅素是藤茶總黃酮中主要抗氧化活性成分。

二氫楊梅素對(duì)動(dòng)物油和植物油均有很強(qiáng)的抗氧化作用。楊梅素?zé)o論對(duì)水溶性食品(飲料、冷飲、維生素C)或脂溶性食品(食用油脂、乳脂、人造奶油、蛋黃醬、維生素D)，均能發(fā)揮很好抗氧化作用，特別在護(hù)色、防止油脂酸敗和香氣劣化等方面，具有很強(qiáng)優(yōu)越性，作用明顯強(qiáng)于合成抗氧化劑3，5-二叔丁基-4-羥基甲基苯(BHT)和蘆丁［7］。因此，二氫楊梅素和楊梅素可作為天然抗氧劑應(yīng)用于食品保藏。但是，二氫楊梅素在藤茶中含量高，且廣泛存在于多種藥食同源的植物中，提取方法簡(jiǎn)單［1］，比楊梅素更易獲得，因此二氫楊梅素比楊梅素更具經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

本文明確了二氫楊梅素、楊梅素的抗氧化作用，今后將進(jìn)一步研究它們的抗氧化作用機(jī)制。

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