不同提取方法對軟棗獼猴桃多糖單糖組成及抗氧化活性的影響

宣 麗，劉長江

沈陽農業大學食品學院，沈陽 110866

軟棗獼猴桃［Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.］別名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物。在我國分布于東北、華北、山東、西北及長江流域，其中，東北南部山區較多見［1］。軟棗獼猴桃以其耐寒性而著稱，果實很小，如棗般大，表皮光滑無毛，可直接食用，甜酸比適中，風味極佳［2］。它富含多種營養成分，如高VC含量(200～400 mg/100 g)、高活性的蛋白酶、種類齊全的微量元素［3］、豐富的不飽和脂肪酸含量［4］等。其果實、種子及根莖均可入藥［5］，是理想的綠色食品和食療食品。多糖是軟棗獼猴桃中主要成分之一，對其進行深入研究對于軟棗獼猴桃的開發利用有重要意義。本文以軟棗獼猴桃鮮果為原料，采用高溫、低溫和微波三種不同方法提取多糖，然后對其單糖組成及抗氧化活性進行研究，以期為軟棗獼猴桃多糖的構效分析提供一定的試驗依據和理論基礎。

1 材料與儀器

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省撫順山區;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自Sigma公司;單糖標準品:鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)及半乳糖醛酸(GalA)購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;其余試劑為國產分析純。

U-2910型紫外可見分光光度計(日立先端科技股份有限公司);Heto-LL3000凍干機(賽默飛世爾科技公司);TSQ-280搖床(上海精宏儀器有限公司);HC23B-AV型微波爐(上海新儀微波化學科技有限公司);HH-4數顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);5805型高速冷凍離心機(德國艾本德公司);RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司);C18色譜柱(賽默飛世爾科技公司)。

2 實驗方法

2.1 軟棗獼猴桃多糖的制備

準確稱取300 g軟棗獼猴桃鮮果，洗凈破碎后，采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇濃度80%，浸泡時間60 min，料液比 1∶2(g∶mL)，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分稱重后平均分成3份，一份采用高溫水提工藝:水浴溫度100℃、料液比1∶9(g∶mL)、水浴時間2 h;一份采用低溫水提工藝:搖床溫度40℃、料液比 1∶9(g∶mL)、振搖時間 2 h、轉速 180 rpm;一份采用微波輔助提取工藝:料液比1∶9(g∶mL)、微波功率500 W、微波處理時間10 min，提取結束后，離心獲得的上清液分別進行減壓濃縮，然后用4倍體積的無水乙醇沉淀，4℃冷藏過夜，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，分別得高溫提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-1、低溫提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-2、微波提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-3，根據公式:多糖得率/%=多糖質量/鮮果質量×100，分別計算三種方法提取的軟棗獼猴桃多糖的得率。

2.2 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖理化性質的比較

精確稱取 AAP-1、AAP-2、AAP-3 各 0.5 g，用 80 mL蒸餾水復溶，溶液用布氏漏斗抽濾，濾液轉移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻后得質量濃度為5 mg/mL的多糖溶液。通過碘-碘化鉀試劑檢測軟棗獼猴桃多糖中是否含有淀粉;三氯化鐵試劑檢測是否含有酚羥基;斐林試劑檢測是否含有還原糖;咔唑-硫酸試劑檢測是否含有糖醛酸;紫外吸收280 nm檢測是否含有蛋白質［6］。

2.3 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的單糖組成分析

2.3.1 軟棗獼猴桃多糖水解

精確稱取不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖樣品40 mg于具塞試管中，分別加入2 mol/L的H2SO4溶液4 mL，于100℃水浴鍋中水解2 h，冷卻至室溫，反應混合物3000 rpm離心5 min，取上清液2 mL用6 mol/L的NaOH溶液中和到pH約為7，溶液用于PMP衍生化。

2.3.2 單糖衍生物的制備［7］

精密吸取濃度為4 mmol/L的單糖對照品、單糖混合液及軟棗獼猴桃多糖水解液各250 μL，于具塞試管中，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液250 μL和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液 250 μL，混勻，置于70℃水浴反應30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L的鹽酸250 μL進行中和，加入1 mL氯仿萃取，充分震蕩后，小心用注射器吸棄下層有機相，重復3次，上層為水相，加入去離子水400 μL稀釋混勻，然后經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，20 μL 進樣分析。

2.3.3 HPLC 分析方法

采用Waters色譜系統。檢測波長為250 nm;柱溫為室溫;流速1.0 mL/min;流動相:溶劑 A:0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH6.9);溶劑B:乙腈;梯度洗脫模式:0→5→10→15 min對應:17%→20%→23%→26%(B);進樣體積20 μL。

2.4 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖體外抗氧化活性的測定

2.4.1 總還原力的測定

實驗方法參考文獻［8］。精確量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后依次加入 2.5 mL 0.2 mol/L pH值6.6磷酸緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中保溫20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液，以4000 rpm離心10 min，取上清液加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，振蕩搖勻，靜置10 min后在700 nm處測其吸光值，以空白管調零點，比較不同樣品的總還原力。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的測定

實驗方法參考文獻［8］。精確量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，混勻后置暗處，室溫反應30 min后，以蒸餾水調零點，在517 nm處測定空白管的吸光值Ac、樣品管的吸光值As，Vc為陽性對照。半抑制濃度IC50，根據濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時對應的濃度值計算，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計算DPPH自由基的清除率。

2.4.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

實驗方法參考文獻［8］。精確量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入10 mmol/L的FeSO41 mL，10 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL啟動反應，37℃反應30 min，在510 nm下測定空白管的吸光值Ac、樣品管的吸光值As，Vc為陽性對照。半抑制濃度IC50，根據濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時對應的濃度值計算，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計算羥基自由基的清除率。

2.4.4 超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力的測定

實驗方法參考文獻［8］。精確量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入4.5 mL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HC1緩沖液，混勻，于25℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后于25℃恒溫水浴中反應5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL，終止反應，于320 nm處測定空白管的吸光值Ac、樣品管的吸光值As，Vc為陽性對照，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計算超氧陰離子自由基的清除率。

3 結果與討論

3.1 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的得率及理化性質的比較

表1 AAP-1、AAP-2及AAP-3的得率及理化性質比較Table 1 Yield，physical and chemical characteristics of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由表1可知，三種方法提取的軟棗獼猴桃多糖均為白色，表明其中的色素類雜質在乙醇除雜、乙醇沉淀、不同極性溶劑的洗滌過程中已全部除去;三種多糖中均未檢測到酚羥基和還原糖，但都含有一定數量的糖醛酸和蛋白質。AAP-1的得率最高，但其中檢測到淀粉;AAP-2得率最低，其中未檢測到淀粉;AAP-3的得率略低于AAP-1，但該法的提取時間為10 min，遠低于高溫提取的2 h，并且其中未檢測到淀粉。綜上所述，低溫處理不利于軟棗獼猴桃中多糖的溶出，該法得率最低;高溫長時處理可以使軟棗獼猴桃中的淀粉溶出;微波輔助提取法可以使軟棗獼猴桃多糖在短時間內大量溶出，而且其中不含淀粉，提取效率最高。

3.2 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的單糖組成

圖1分別給出了混標、AAP-1、AAP-2及AAP-3的PMP衍生物的高效液相色譜圖。各峰的出峰時間和所代表的化合物如表2所示。

圖1 混標、AAP-1、AAP-2、AAP-3水解衍生物的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of monosaccharide standard，AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖1、表2可知，通過硫酸水解、PMP柱前衍生測定軟棗獼猴桃多糖的單糖組成，結果表明不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7種單糖組成，但各單糖的含量有顯著差異，其中差異最為顯著的是葡萄糖和半乳糖醛酸，用面積歸一法計算［9］，各單糖的摩爾百分含量如表3所示。

表2 標準單糖及AAP-1、AAP-2、AAP-3水解衍生物的保留時間(min)Table 2 Retention time of standard monosaccharide and AAP-1，AAP-2，AAP-3 hydrolysate derivatives(min)

表3 AAP-1、AAP-2、AAP-3單糖組成的差異Table 3 The difference of monosaccharide composition ratio of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由表3可知，AAP-1、AAP-2、AAP-3三種多糖中葡萄糖的摩爾百分含量差異顯著，半乳糖醛酸的摩爾百分含量依次升高。AAP-1葡萄糖的摩爾百分含量最高，可達到94.72%，這可能是AAP-1中含有淀粉的緣故;AAP-2葡萄糖的摩爾百分含量顯著降低，僅為9.89%，半乳糖和阿拉伯糖的摩爾百分含量顯著升高，半乳糖醛酸和甘露糖的摩爾百分含量也有所上升，表明AAP-2中含有果膠多糖;AAP-3葡萄糖的摩爾百分含量較AAP-2有所上升，但遠低于AAP-1，為21.97%，半乳糖醛酸的摩爾百分含量繼續升高，達到16.05%，阿拉伯糖的摩爾百分含量較AAP-2下降明顯，其余四種單糖的摩爾百分含量與AAP-2相差不大，表明AAP-3中含有大量的果膠多糖。

3.3 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖抗氧化活性的測定

3.3.1 總還原力的測定

圖2 AAP-1、AAP-2、AAP-3 的總還原力Fig.2 Reducing power of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

據報道，抗氧化活性與總還原力之間存在極大的相關關系［8］。由圖 2 可以看出，AAP-1、AAP-2、AAP-3均具有一定的還原力，并且呈現出明顯的劑量依賴性關系。其中AAP-3的總還原力最強，AAP-2次之，AAP-1的總還原力最弱。

3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

圖3 AAP-1、AAP-2、AAP-3對DPPH自由基清除能力的測定Fig.3 DPPH·-scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖3可知，AAP-1、AAP-2、AAP-3都對 DPPH·有一定的清除作用，而且在0.5～4mg/mL濃度范圍內隨著濃度的升高清除率逐漸增大，呈現量-效關系。經計算，AAP-1、AAP-2、AAP-3的 IC50分別為:3.7、3.2、1.2 mg/mL，表明 AAP-3 清除 DPPH·的效果明顯高于 AAP-1和 AAP-2，當 AAP-3濃度為4 mg/mL時，對DPPH·的清除率可以達到94%，但Vc的IC50僅為0.03 mg/mL，AAP-3與其相比還有很大差距。

3.3.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

圖4 AAP-1、AAP-2、AAP-3對羥基自由基清除能力的測定Fig.4 ·OH scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖4可知，隨著軟棗獼猴桃多糖濃度的升高，其對羥基自由基的清除率逐漸增大，呈現量-效關系。但AAP-1清除羥基自由基的能力明顯弱于AAP-2和AAP-3，當 AAP-1濃度為5 mg/mL時，對羥基自由基的清除率僅為12.8%。AAP-2、AAP-3的 IC50分別為:3.8、2.7 mg/mL，表明 AAP-3 的清除效果優于 AAP-2，Vc的 IC50為0.2 mg/mL，AAP-3 與其相比也存在較大差距。

圖5 AAP-1、AAP-2、AAP-3對超氧陰離子自由基清除能力的測定Fig.5 O2-·scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖5可知，軟棗獼猴桃多糖對超氧陰離子自由基的清除能力很弱，AAP-3的清除能力相對較強，但當多糖濃度達到5 mg/mL時，清除率也只有8.2%。

綜上所述，軟棗獼猴桃多糖具有較強清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，但清除超氧陰離子自由基的能力很弱。結合理化性質和單糖組成的實驗結果可以發現:三種多糖的最大差別在于糖醛酸的含量，并且推測這一差別可能直接導致三種多糖在抗氧化活性方面的差異，因為有研究表明糖醛酸的含量對果膠多糖的功能特性起著決定性的作用［10］，因此后續實驗需對微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖進行深入研究，以確定其活性組分及相關結構特征。

4 結論

采用高溫水提工藝、低溫水提工藝和微波輔助提取工藝得到的三種軟棗獼猴桃多糖均為白色，都不含酚羥基和還原糖，但都含有一定數量的糖醛酸和蛋白質。AAP-1含有淀粉;AAP-2、AAP-3不含淀粉;三種多糖均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7種單糖組成，AAP-1因含有淀粉，葡萄糖的摩爾百分含量最高，AAP-2和AAP-3為果膠多糖，含有較多的甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖;AAP-3的抗氧化活性最強，AAP-2次之，AAP-1最弱。本文對軟棗獼猴桃多糖的單糖組成分析及抗氧化活性測定為軟棗獼猴桃在食品、醫藥和保健方面的開發應用提供可靠的科學依據。

1 Sun NN(孫寧寧).Component analyzes and refreshing study on Actinidia arguta in Changbaishan.Jilin:Jilin Agricultural University(吉林農業大學)，MSc.2007.

2 Kim JG，Takami Y，Mizugami T，et al.CPPU application on size and quality of hardy kiwifruit.Sci Hortic，2006，110:219-222.

3 Kim JG，Beppu K，Kataoka I.Varietal differences in phenolic content and astringency in skin and flesh of hardy kiwifruit resources in Japan.Sci Hortic，2009，120:551-554.

4 Jiang AL(姜愛麗)，Shen X(申新)，Hu WZ(胡文忠)，et al.Supercritical CO2fluid extraction and fatty acid composition analysis of kiwi seed oil.China Oils Fats(中國油脂)，2008，33(9):77-79.

5 Xu YX(徐一新)，Xiang ZB(項昭保)，Chen HS(陳海生).The research progress of chemical composition and biological activity of actinidia plants.Pharm J Chin PLA(解放軍藥學學報)，2011，27:164-169.

6 Wu WL，Zhu YT，Zhang L，et al.Extraction，preliminary structural characterization，and antioxidant activities of polysaccharidesfrom Salvia miltiorrhiza Bunge.Carbohydr Polym，2012，87:1348-1353.

7 Yang XB(楊興斌)，Zhao Y(趙燕)，Zhou SY(周四元)，et al..Analysis of monosaccharide composition in Angelica polysaccharides by precolumn derivatization high performance liquid chromatography.Chin J Anal Chem(分析化學)，2005，33:1287-1290.

8 Wang F(王菲).Extraction and purification and biological activities of flavonoids from fruit of Actinidia auguta.Shenyang:Shenyang Agricultural University(沈陽農業大學)，PhD.2011.

9 Wang ZF(汪正范).Chromatography Qualitative and Quantitative(色譜定性與定量).Beijing:Chemical Industry Publishing House，2000:163-169.

10 Sun YL(孫元琳).Preparation，structural features and radioprotective effect of polysaccharides from Angelica sinensis(Oliv.)Diels.Wuxi:Jiangnan University(江 南 大 學)，PhD.2006.