鎘損傷小鼠心臟形態學研究及咖啡酸苯乙酯的保護作用

陳福欣，龔 頻，王 靜，馬養民*，周安寧

1西安科技大學化學與化工學院，西安 710054;2教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室，陜西科技大學，生命與工程學院，化學與化工學院，西安 710021

重金屬鎘是一種分布廣泛、毒性持久的環境污染物。極低劑量的鎘中毒就能誘導心血管疾病的發生［1，2］，有研究發現其毒性與氧化應激有關;但其毒性作用機制尚未明確。我們之前的研究發現，咖啡酸苯乙酯(CAPE)對鎘誘導的心臟損傷具有保護作用［3］，可能與其抗氧化作用有關。但目前通過直觀的組織形態學觀察證實鎘對心臟的損傷以及CAPE的保護作用鮮見報道。本研究利用光鏡技術觀察了鎘對小鼠心臟的損傷作用及CAPE對心臟損傷的保護作用，并探討了CAPE的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠30只，鼠齡1個月左右，20 g左右，購自第四軍醫大學實驗動物中心，實驗前適應性飼養3 d，自由取食飲水。CAPE合成于本實驗室，其化學結構通過1H-NMR(Burker，400 MHz)和質譜(Mariner 5074，Framingham，MA，USA)驗證，純度經高效液相色譜分析達98%。氯化鎘(CdCl2)購自天津市福晨化學試劑廠，生理鹽水購自西安京西雙鶴藥業有限公司，蘇木精、曙紅、N-(1-萘基)-乙二胺、對氨基苯磺酸購自瑞士阿達瑪斯公司，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型構建

隨機將小鼠分成5組、每組6只，空白組(A組):腹腔注射生理鹽水0.2 mL;鎘損傷組(B組):腹腔注射 CdCl2水溶液1 mg/(kg·d);低劑量CAPE保護組(C組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和 CAPE 0.1 μM/(kg·d);中劑量 CAPE 保護組(D組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 1 μM/(kg·d);高劑量CAPE保護組(E組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 10 μM/(kg·d)。每天給藥1次，持續給藥7 d。根據小鼠心肌脂質過氧化反應的程度來判斷模型是否構建成功［3］。

1.2.2 組織形態學切片的制作

最后1次注藥24 h后，斷頸處死小鼠，取新鮮心臟組織保存在10%的福爾馬林中，梯度脫水，包埋于石蠟，制作厚度為5 μm的切片，蘇木精—曙紅染色，400×光鏡下觀察心肌細胞形態。

1.2.3 NO 的含量測定

取新鮮心臟組織，用預冷的磷酸緩沖液(pH 7.4)勻漿，100 μL 樣品加入等體積的 0.1%N-(1-萘基)-乙二胺、1%對氨基苯磺酸，利用Griess反應來測定心臟組織中NO的含量。原理:堿性環境下，溶液中的NO-2可與對氨基苯磺酸發生重氮化反應，再與N-(1-萘基)-乙二胺偶聯，生成紫紅色產物，測量其在540 nm下的吸光值，由測定的NO-2含量間接的反映NO的含量。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 CAPE的金屬螯合能力檢測

CAPE與二價鐵離子的螯合實驗按照Gong等［4］的方法進行。不同體積、濃度為1 mg/mL的CAPE加入到1 mmol/L的(NH4)2Fe(SO4)2(溶于NaAc-HAc緩沖液，pH 5.0)溶液中，通過加入 4 mmol/L的鄰菲羅啉(溶于 NaAc-HAc緩沖液，pH 5.0)來起始反應，反復振蕩混合物，室溫下靜置10 min。當反應達到平衡后，于510 nm檢測吸收值。重復3次，取均值。Fe2+-鄰菲羅啉一水化物復合體形成的抑制百分比=(1－A1/A0)×100%。其中A0是空白的吸收值，A1是含有CAPE樣品的吸收值。空白中不含有 1，10-鄰菲羅啉一水化物及(NH4)2Fe(SO4)2。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 心肌細胞的組織學形態

組織形態學研究表明，空白組心肌細胞排列整齊，無炎癥細胞侵潤;損傷組中，鎘毒性能夠引起心肌細胞小灶狀壞死，產生空泡及炎癥細胞的侵潤，此外，觀察到心肌細胞腫脹;然而在CAPE保護組，C組中，仍有心肌細胞壞死及大量的空泡結構，而D組空泡形成減少、心肌細胞基本正常，E組心肌細胞結構完整，無炎癥細胞的侵潤等，結果表明鎘對心臟的毒性損傷及CAPE的保護作用。

圖1 鎘對心臟NO含量的影響以及CAPE的保護作用Fig.1 The influence of cadmium on cardiac NO content and the protective effect of CAPE

圖2 不同濃度CAPE的金屬螯合能力Fig.2 Metal chelating capacities of different concentrations of CAPE

2.2 各組NO含量及CAPE的金屬螯合能力比較

通過測定鎘損傷組及CAPE保護組NO含量，發現鎘毒性能夠降低NO水平，為正常組的87.1%(P ＜0.05)，而CAPE的保護作用能夠抑制NO的減低(P ＜ 0.05)(圖1)。

如圖2所示，CAPE的金屬螯合數據表明CAPE可以呈濃度依賴螯合Fe2+，具有金屬螯合作用。

3 討論

鎘致心臟損傷的發病機制與其影響因素有關。研究表明鎘毒性作用能夠誘導氧化應激，導致脂質過氧化反應(Lipid Peroxidation，LPO)的增加;鎘還能夠通過減少一氧化氮(NO)的釋放誘導血管內皮細胞的損傷［5］;此外，炎癥反應也是心臟損傷的關鍵誘因［6］。

CAPE是中藥蜂膠的主要活性成分，具有廣泛的生理藥理活性，包括抗氧化、抗病毒、抗動脈硬化、抗菌、抗炎、誘導細胞凋亡和提高機體免疫力等［7］。我們之前的研究顯示，CAPE對鎘致心臟損傷具有保護作用，其機制可能與CAPE的抗氧化作用有關。本研究從組織病理學角度觀察了鎘致心臟損傷形態學的改變及CAPE的保護作用。空白組心肌細胞排列整齊，無炎癥浸潤;損傷組產生空泡，心肌細胞發生腫脹;而CAPE能夠明顯抑制鎘對心肌細胞造成的損傷。說明鎘毒性能夠對心肌細胞造成損傷，破壞正常的細胞形態，影響功能，然而CAPE的保護作用能夠緩解損傷，減少鎘的毒害，與文獻報道一致［8］。

NO可能是自由基毒性的保護因子，氧自由基通過下調NO的合成，從而損傷心臟功能，因此鎘的心臟毒性可能與心臟組織中NO含量的減少有關。CAPE能夠提高心臟組織中NO的含量，可能的途徑有直接增加NOS的活性、激活某些酶協同因子的產生或通過清除自由基，阻止自由基對NO產生的抑制作用［9］。通過測量NO的含量，從另一方面探討了CAPE對鎘誘導心臟損傷的保護機理。

鎘致心臟損傷的毒性機制還可能和鎘與生物大分子的結合有關，進而導致關鍵酶的失活或者引起DNA鏈的斷裂，形成惡性循環［3］。CAPE呈濃度依賴的螯合Fe2+，證明CAPE具有較強的金屬螯合能力。因此，CAPE能夠保護心臟免受鎘損傷可能是通過螯合體內游離的鎘離子，減弱鎘對生物大分子的損傷，起到類似于金屬硫蛋白的作用。CAPE的金屬螯合能力主要與其分子結構有關。CAPE雙鍵共軛的苯環上3，4位各有一個酚羥基，相鄰的酚羥基能以氧負離子的形式與金屬離子形成穩定的五元環螯合物，從而發生絡合反應［10］。本研究從另一方面闡明了CAPE對鎘致心臟損傷的保護機理，也為重金屬的解毒提供了新思路，對CAPE藥物開發提供了理論依據和數據支持。

綜上所述，鎘通過抑制NO的釋放，改變小鼠心肌細胞的正常形態，損傷其正常機能;CAPE對鎘致心臟損傷的保護途徑可能是通過螯合金屬離子，減弱其對生物大分子的損傷，起到類似于金屬硫蛋白的作用。

1 Messner B，Bernhard D.Cadmium and cardiovascular diseases:cell biology，pathophysiology，and epidemiological relevance.Biometals，2010，23:811-822.

2 Zhan J(詹杰)，Zhou QX(周啟星)，Wei SH(魏樹和).Advanced study of toxicity mechanism of cadmium on cardiovascular damage.Asian J Ecotoxicol(生態毒理學報)，2011，5:466-470.

3 Gong P(龔頻)，Chen FX(陳福欣)，Wang J(王靜)，et al.Protection effect of caffeic acid phenethyl ester on cadmiuminduced mice cardiac damage.J Toxicol(毒理學雜志)，2012，26:49-53.

4 Gong P，Chen FX，Ma GF，et al.Endomorphin 1 effectively protects cadmium chloride-induced hepatic damage in mice.Toxicology，2008，251:35-44.

5 Chen Y(陳玨)，Jin TY(金泰廙)，Li PJ(李憑建).Adverse effect of cadmium on HUVEC.J Environ Med(環境與職業醫學)，2004，3:165-169.

6 Libby P.Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.Am J Clin Nutr，2006，83:456-460.

7 Wang XF(王秀芳)，Zhai S(翟嵩)，Dang SS(黨雙鎖).Review of the pharmacological action and mechanism of caffeie acid phenethyl ester.Foreign Med Sci(Section of Medgeography)(國外醫學，醫學地理分冊)，2010，31:187-190.

8 Mollaoglu H，Gokcimen A，Ozguner F，et al.Caffeic acid phenethyl ester prevents cadmium-induced cardiac impairment in rat.Toxicology，2006，227:15-20.

9 Koltuksuz U，Irmak MK，Karaman A，et al.Testicular nitric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsion in rats pretreated with caffeic acid phenethyl ester.Urol Res，2000，28:360-363.

10 Song LJ(宋立江)，Di Y(狄瑩)，Shi B(石碧).The significance and development trend in research of plant polyphenols，Prog in Chem(化學進展)，2000，12:161-170.