DAPT對人膠質瘤細胞系SHG－44增殖的抑制作用及機制

倪偉民 房 艷 衣服新 邱建武 叢 明 王 冰

(遼寧醫學院附屬第一醫院神經外科，遼寧 錦州 121000)

最新研究表明，引起腫瘤復發轉移生長的細胞只占全部腫瘤細胞的很小部分，稱之為腫瘤干細胞(TSC)。近年來國內外學者相繼從腦膠質瘤組織和細胞株中成功分離出腦膠質瘤TSC〔1〕(BTSC)，其在膠質瘤的發生、發展及復發過程中均起著決定性作用。研究表明Notch信號通路〔2〕在正常干細胞和TSC的自我更新、增殖及分化過程中起主要的調控作用，該通路的關鍵蛋白在腫瘤細胞的增殖過程中表達異常。氮-〔氮-(3，5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰〕-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，是目前公認為Notch信號通路的阻斷劑。但DAPT在抗腫瘤方面的研究尚少，本文擬分析DAPT對SHG-44細胞增殖的抑制情況及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、試劑和儀器 人膠質瘤SHG-44細胞株購自中科院上海細胞庫。L-DMEM培養基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，總RNA提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，RT-PCR一步法試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DAPT購自瑞士ALEXIS公司，碘化丙啶(PI)、MTT購自美國Amersco公司。抗Notchl、抗Deltal、抗Hes1購自美國Chemicon公司;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，凝膠成像系統為北京Tanon公司產品，PCR儀為美國MJ Research公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 常規復蘇SHG-44細胞，L-DMEM培養液(10%FBS)、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每3 d換液，達90%融合時傳代培養。

1.2.2 實驗分組 將SHG-44細胞隨機分5組，分別應用不同濃 度 的 DAPT，A 組:0 μmol/L;B 組:0.5 μmol/L;C 組:1.0 μmol/L;D 組:5.0 μmol/L;E 組:10.0 μmol/L。L-DMEM(10%FBS)，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，每3 d換液。

1.2.3 MTT法檢測DAPT對SHG-44細胞增殖的影響 取傳代培養的SHG-44細胞，0.25%胰酶消化，以1×104ml－1的細胞懸液接種于96孔板，培養24 h后，按上述5組的濃度加入DAPT，于5 d內的每 24 h取出一板，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸棄培養液，每孔加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶聯免疫儀選擇570 nm波長測定各孔的光吸收值(OD值)，繪制各組細胞的增殖曲線。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 收集上述5組不同濃度DAPT處理的SHG-44細胞48 h后，0.25%胰酶消化，計數細胞，調整細胞密度為1×106ml－1，4℃ 1 000 r/min離心5 min，細胞沉淀加入預冷的70%乙醇輕輕吹打懸浮，4℃固定過夜。次日固定后的細胞800 r/min離心5 min，加500 μl的PI染液(0.05‰ PI，0.02‰ Rnase)吹打懸浮，4℃避光靜置染色30 min，上機檢測。

1.2.5 流式細胞術檢測CD133+的細胞比例 應用上述5組濃度DAPT處理SHG-44細胞48 h后，胰酶消化，計數細胞，調整細胞密度為1×106ml－1。4℃ 1 000 r/min離心5 min，將細胞重懸并移入 EP管(100 μl/管)，每管加入 FITC標記的CD133抗體10 μl，以不加抗體作為陰性對照，避光孵育30 min，PBS洗滌以去除未結合的抗體，4℃ 1 000 r/min離心5 min，加500 μl PBS，上機檢測。

1.2.6 RT-PCR 檢測 Notch-1，Delta-l，Hes-1 mRNA 的表達DAPT處理SHG-44細胞48 h后，收集各組細胞，每2×106個細胞加入1 ml Trizol，消化細胞提取總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA濃度與純度。應用Takara的RT-PCR試劑盒，逆轉錄反應按照說明書進行:52℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，合成cDNA，PCR擴增。PCR結束后將反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像分析系統拍照，并利用圖像分析軟件Gene Tools分析結果。PCR擴增引物與退火溫度見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western印跡法檢測Notch-1，Delta-l，Hes-1蛋白的表達

DAPT處理SHG-44細胞48 h后，收集各組細胞，用RIPA細胞解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，充分混合沉淀加上樣緩沖液，SDS-PAGE變性凝膠電泳，轉膜印跡，封閉，兔抗人Notch-1(1∶1 000)，Delta-l(1∶800)，Hes-1(1∶1 000)一抗孵育，4℃靜置過夜，洗滌，結合HRP標記的二抗，洗滌，HRP-ECL發光。

2 結果

2.1 細胞的形態觀察 經DAPT處理48 h后SHG-44細胞出現了明顯的形態和數量變化:A組細胞數目多，梭形細胞為主，不規則細胞比例較低，細胞間黏附完好，密集排列于培養板底。B組細胞數目較A組稍有減少，形態變化不明顯;C組經1.0 μmol/L DAPT處理的SHG-44細胞數目明顯減少，不規則及大體積細胞比例增多，細胞稀疏分布于培養瓶底。D、E組細胞數目減少更加明顯，可見細胞壞死崩解，殘存細胞形態不規則，邊緣不整，不易貼壁而懸浮于培養液中。見圖1。

圖1 各組SHG-44細胞的形態變化(相差顯微鏡，×100)

2.2 MTT檢測結果 與A組比較，B、C、D、E組的SHG-44細胞增殖均受到DAPT的抑制，其中B組與A組比較具有明顯差異(P＜0.05)，但B組增殖程度明顯高于C、D、E組(P＜0.05)。表明隨著DAPT濃度的增加，抑制作用增強，但C、D、E組無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以明顯抑制SHG-44細胞增殖，并具有DAPT濃度依賴性，而C組的抑制效果已比較顯著，且與更高濃度組無顯著差異，可以成為首選治療濃度(圖2)。

圖2 各組SHG-44細胞的增殖曲線

2.3 DAPT對SHG-44細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，與A組比較，B、C、D、E各組的SHG-44細胞經DAPT作用48 h后，G0/G1期細胞比例顯著增加(P＜0.05)，S期細胞明顯減少(P＜0.05)。B組各期細胞比例的變化明顯低于C、D、E組(P＜0.05)，而C、D、E組之間無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以使SHG-44細胞聚集于G1/G0期，降低S期細胞比例，C組即可達到明顯的抑制作用(表2)。

表2 各組SHG-44細胞各期細胞的百分比(±s，n=20，%)

表2 各組SHG-44細胞各期細胞的百分比(±s，n=20，%)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

分組 G0/G1 S G2/M A組56.25±1.31 28.47±1.24 15.38±0.87 B組 61.97±5.801) 23.89±4.421) 15.25±3.61 C組 67.19±4.721)2) 18.57±2.301)2) 14.05±1.53 D組 68.73±7.681) 18.45±2.201) 13.82±1.36 E組 70.58±9.441) 16.39±3.351)13.03±3.41

2.4 CD133+的TSC比例 流式細胞術檢測結果顯示，B、C、D、E組的SHG-44細胞經DAPT作用48 h后，CD133+細胞比例明顯下降，表達量分別是 A組為(25.75±2.13)%，B組為(19.57±3.04)%，C組為(15.91±2.98)%，D組為(10.15±2.33)%，E 組為(7.02±3.17)%。與 A 組比較，B、C、D、E 組均明顯下調了CD133+細胞比例(P＜0.05);而隨藥物濃度增加CD133+細胞比例下降越明顯(F=66.12，P=0.002)。表明DAPT使SHG-44細胞中CD133+的TSC比例明顯下降，具有明顯劑量依賴性。

2.5 RT-PCR檢測結果 Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1表達水平的變化趨勢基本一致。與A組比較，4組經DAPT處理的細胞這3種基因表達水平明顯降低(P＜0.05)。而B組的表達水平明顯高于 C、D、E組(P＜0.05)，但C、D、E組之間表達水平無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以下調SHG-44細胞中Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的表達水平，C組效果與D、E高濃度組無明顯差異，可以作為藥物濃度的最佳選擇(圖3)。

圖3 各組SHG-44細胞后的基因表達

2.6 Western印跡結果 與A組比較，B、C、D、E組的3種蛋白表達水平明顯減弱(P＜0.05)。而B組的表達水平明顯高于C、D、E 組(P＜0.05)，C、D、E 組之間表達水平無明顯差異(P ＞0.05)。表明DAPT可以下調SHG-44細胞中Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的蛋白表達，C組下調效果與D、E高濃度組無明顯差異(圖4)。

圖4 各組SHG-44細胞后的蛋白表達

3 討論

膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，發病率、死亡率都很高，病程難以控制。其傳統的化療藥物主要針對高度增殖的腫瘤細胞，最大限度地清除或殺滅腫瘤組織和細胞。TSC的存在是導致腫瘤的復發、轉移及化學耐藥等的根本問題。Notch信號通路在干細胞和TSC的增殖分化中起重要作用，并發現Notch信號通路在多種腫瘤中異常活化〔3〕。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體和CSL(一種DNA結合蛋白)三部分組成，配體與受體結合后，Notch受體相繼發生兩次蛋白水解。第二次是由γ-分泌酶(γ-secretase，又稱早老蛋白presenilin，PS)在跨膜區靠近胞膜內的位點切割蛋白，使具有核定位信號的胞質內區域(NICD)釋放入細胞質，進入細胞核與DNA結合蛋白CSL相互作用，導致下游的Hes、Hey、HERP、bHLH基因激活，影響細胞的增殖、分化和凋亡〔4〕。γ-分泌酶是Notch信號激活過程中的關鍵酶〔5〕。應用γ-分泌酶抑制劑可以阻斷Notch信號通路中NICD的產生，從而抑制NICD引發的細胞分化、增殖和凋亡的異常。另外γ-分泌酶抑制劑還能干擾腫瘤細胞與脈管上皮細胞之間的Notch信號轉導，從而抑制腫瘤中血管的生成。DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，被公認為Notch信號通路的有效阻斷劑，經證明在抗腫瘤方面具有潛在作用〔6〕。

本實驗提示1.0 μmol/L DAPT可成為臨床治療的有效濃度。有研究〔7〕檢測了6種人腦膠質瘤細胞系和原發性人腦膠質瘤中Notch-1及其配體Delta-1、Jagged-1 mRNA和蛋白的表達，結果三者均呈過度表達，另外，免疫組化染色顯示絕大多數Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤中Notch-1蛋白有中到高水平表達。本實驗結果提示腫瘤的惡性程度與Notch的活化相關。結合MTT和細胞周期檢測結果，DAPT對膠質瘤細胞系SHG-44的增殖抑制作用有可能與Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下調有關。Hes-1蛋白還能通過抑制Cyclin依賴性激酶抑制因子p27的轉錄而促進細胞增殖〔8〕，下調Hes-1的表達則起到抑制細胞增殖的作用。本研究還發現DAPT可使SHG-44細胞系中CD133+比例明顯下降，降為原來的四分之一左右。Fan等〔9〕發現在體外培養的BTSC中，阻斷Notch信號，CD133表達陽性細胞數量降為原來的五分之一。與本實驗結果基本一致。CD133+被認為是BTSS的特征性標記，CD133+細胞表達比例下降提示SHG-44細胞系中TSC明顯減少。抑制Notch通路可明顯抑制TSC的增殖，其下降機制也可能與Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下調有關。同時TSC的減少也是抑制腫瘤增殖的重要手段，可能為惡性腫瘤的根治提供幫助。

綜上，DAPT可通過阻斷Notch信號通路抑制SHG-44細胞的增殖，1.0 μmol/L的藥物濃度即可達到明顯的作用效果，DAPT細胞毒性低，副作用少;DAPT可以明顯抑制TSC增殖。

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5 Wang Z，Zhang Y，Banerjee S，et al.Inhibition of nuclear factor kappab activity by genistein is mediated via Notch-1 signaling pathway in pancreatic cancer cells〔J〕.Int J Cancer，2006;118(8):1930-6.

6 Grottkau BE，Chen XR，Friedrich CC，et al.DAPT enhances the apoptosis of human tongue carcinoma cells〔J〕.Int J Oral Sci，2009;1(2):81-9.

7 Purow BW，Haque RM，Noel MW，et al.Expression of Notch-1 and its ligands，Delta-Like-1 and Jagged-1 is critical for glioma cell survival and proliferation〔J〕.Cancer Res，2005;65(6):2353-63.

8 Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2006;5(3):483-93.

9 Fan X，Matsui W，Khaki L，el al.Notch pathway inhibition depletes stemlike cells anti blocks engraftment in embryonal brain tumors〔J〕.Cancer Res，2006;66(15):7445-52.