丹皮酚對人乳腺導管癌細胞MDA－MB－435增殖的影響

王建杰 羅文哲 苗 智 閆冬梅 王茉琳 (佳木斯大學基礎醫學院免疫教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

丹皮酚是牡丹皮中的主要活性成分〔1〕，能抑制某些腫瘤細胞的增殖，如人白血病細胞株K562，人肝癌細胞株Bel-7404，人宮頸癌細胞株 HeLa以及人大腸癌細胞株HT-29〔2～4〕。并能夠增強化療藥物順鉑抗食管癌的作用〔5〕。本課題組應用丹皮酚處理EMT6(小鼠乳腺浸潤性導管癌)小鼠實體瘤，證明了丹皮酚能很好地抑制腫瘤生長，并揭示其抗腫瘤機制是誘導了腫瘤細胞凋亡〔6〕。但小鼠與人之間存在著種屬特異性，因此本文選取體外培養的人乳腺導管癌細胞MDA-MB-435作為研究對象，進一步觀察丹皮酚對人MDA-MB-435細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MDA-MB-435購于中國醫學科學院腫瘤研究所細胞庫。

1.1.2 試劑藥品 丹皮酚來自沈陽藥科大學提純分離，純度＞98%。RPMI1640培養液購于Gibco公司，胎牛血清來源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)、蘇木精、伊紅為北京拜爾迪生物技術公司產品。二甲基亞砜(DMSO)為Sigma Aldrich Inc公司產品。流式細胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Becton Dickinson公司;熒光顯微鏡及照相系統為德國萊卡公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人MDA-MB-435細胞以適量濃度接種于9 cm細胞培養皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃，5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。實驗均于細胞處于對數生長期時進行。

1.2.2 MTT法檢測丹皮酚對MDA-MB-435細胞增殖活性的影響 對數生長期的腫瘤細胞以0.25%胰酶消化，調整細胞密度至 5 ×104～1 ×105/ml，并接種于 96 孔培養板中，每孔 100 μl，培養 24 h，加入不同濃度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每個濃度均設4個平行孔，用RPMI1640完全培養液作為陰性對照組，同時設空白調零，放于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24、48 h后，每孔加入5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培養箱中繼續培養 4 h 后，加入 200 μl DMSO 溶液，振蕩10 min后于酶標儀492 nm處測OD值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色檢測丹皮酚對MDA-MB-435細胞形態的影響 處于對數生長期的細胞用胰酶消化，RPMI1640完全培養液配成單細胞懸液，濃度為5×105個/ml。將細胞爬片置于6孔培養板內，每孔加入2 ml細胞懸液，24 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入60 mg/L的丹皮酚，陰性對照組加2 ml RPMI1640完全培養液，放于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24、48 h后，吸盡培養液，取出細胞爬片，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃過夜。常規HE染色。梯度酒精脫水，樹膠封片，光鏡下觀察拍照。

1.2.4 流式細胞儀檢測MDA-MB-435細胞周期 將對數生長期細胞均勻接種于6孔板，60 mg/L藥物處理24、48 h。胰酶消化液進行消化，收集細胞于1.5 ml離心管中。1 500 r/min離心5 min，用75%酒精細胞重懸，洗滌細胞1次。再加入1 ml乙醇固定細胞，流式細胞儀進行細胞周期檢測，結果以CellQuest軟件分析。

1.3 統計學分析 采用t檢驗。

2 結果

2.1 丹皮酚對細胞增殖活性的影響 丹皮酚處理MDA-MB-435細胞 24 h的 IC50高于 250 mg/L，而 48 h后的 IC50約為60 mg/L，說明丹皮酚作用48 h后對MDA-MB-435細胞增殖具有直接抑制作用，并呈劑量依賴性。

2.2 丹皮酚處理后MDA-MB-435細胞形態學 細胞爬片經HE染色，光鏡下可見對照組的MDA-MB-435細胞生長良好，細胞呈多邊形，胞漿多，胞核染色質疏松，染色較淡。而丹皮酚處理MDA-MB-435細胞24、48 h后，細胞生長受到不同程度的抑制，出現細胞胞體變圓，體積縮小，胞漿起泡，部分細胞浮起，胞膜皺縮染色質凝集，核深染等形態變化。見圖1。

2.3 細胞周期分析 60 mg/ml丹皮酚處理24 h和48 h后，MDA-MB-435細胞在G0/G1期的百分數增加，而S期和G2/M細胞數減少，說明丹皮酚阻滯細胞周期從G1到S期的轉化。此外，在丹皮酚處理24、48 h后，均出現了Sub-G1期，與對照組比較差異顯著(P＜0.01)。見圖2。

圖1 丹皮酚(60 mg/L)對MDA-MB-435細胞形態學的影響(HE，×200)

圖2 丹皮酚(60 mg/L)處理后MDA-MB-435細胞周期結果

3 討論

本結果顯示丹皮酚能夠明顯抑制MDA-MB-435細胞增殖。腫瘤細胞的最基本特征是細胞的失控性生長，而失控性增殖的根本原因就是細胞周期調控機制的破壞。腫瘤細胞增殖快慢主要取決于細胞G0/G1期的長短。G0/G1期短，腫瘤細胞增殖快，處于G0/G1期的細胞數少〔7〕。文獻報道，當細胞生長阻滯在G1期達到一定程度和時間后，仍不能解除阻滯將會使細胞無法進入S期，則激活細胞內的某種機制，啟動程序性細胞死亡，從而引發凋亡〔8〕。本文中阻滯于細胞周期從G1到S期，表明丹皮酚影響腫瘤細胞內DNA的復制和合成，抑制細胞的正常分裂，從而抑制腫瘤細胞的增殖，進而導致腫瘤細胞凋亡。凋亡細胞的DNA在內源性核酸內切酶的作用下裂解成180～200 bp或與之成整數倍的寡核苷酸片段，經過染色后顯示DNA峰值時，會在正常二倍體DNA峰(G1)之前出現一個亞二倍體峰(Sub-G1峰)，即凋亡峰。本實驗丹皮酚處理24、48 h后，即出現了凋亡峰。可見丹皮酚阻滯細胞周期在G0/G1期，并誘導了腫瘤細胞凋亡，由此說明丹皮酚發揮抗癌作用的重要機制之一可能是影響了細胞周期和誘導乳腺癌細胞凋亡。

1 孫國平，沈玉先，張玲玲，等.丹皮酚的體內外抗腫瘤作用〔J〕.安徽醫科大學學報，2002;37(3):183-5.

2 潘顯道，費勤志，朱承根，等.5個丹皮酚酯的合成和體外抗腫瘤活性研究〔J〕.安徽醫藥，2004;8(1):16-8.

3 劉長青，譚詩云，計春燕，等.丹皮酚對大腸癌HT-29細胞的增殖抑制作用及其機制的探討〔J〕.中國藥理學通報，2005;21(10):1251-4.

4 Sun GP，Wang H，Xu SP，et al.Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕.Eur J Pharmcol，2008;584(2-3):246-52.

5 Borner C.The Bcl-2 protein family:sensors and checkpoints for life-ordeath decisions〔J〕.Mol Immunol，2003;39(11):615-47.

6 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;29(7):2043-50.

7 Wang JJ，Li QW，Ou YT，et al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma〔J〕.Lat Am J Pharm，2010;29(3):369-89.

8 Evan GI，Vousden KH.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer〔J〕.Nature，2001;411(6835):342-8.