白藜蘆醇對大鼠缺血心肌的保護及對凋亡的抑制作用

何東偉 劉新偉 龐 勇 劉 柳 (重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科，重慶 400016)

缺血再灌注損傷研究中，預處理和后處理均和減輕心肌細胞凋亡有關，即與細胞內的Fas凋亡通路、線粒體凋亡通路等有關，但其確切的分子機制尚不清楚。白藜蘆醇是一種抗自由基、抗氧化劑，能預防、治療動脈粥樣硬化等心血管疾病，有助于血液流通，還能增進血管內皮細胞的功能。在心肌缺血再灌注損傷過程中，心肌損傷的發生是多因素多途徑的，阻斷心肌損傷級聯反應中的關鍵環節和抑制參與多信號途徑的介質是防治心肌損傷和細胞凋亡的最有效方法。磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路是細胞內重要的信號轉導通路，在對抗心肌缺血再灌注損傷、抑制細胞凋亡中發揮重要作用〔1〕。本研究觀察白藜蘆醇預處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用及對心肌細胞凋亡的影響與PI3KAkt信號通路的關系，探討白藜蘆醇保護缺血心肌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠50只，體重220～250 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥品、試劑、及儀器 白藜蘆醇購自四川維克奇生物科技有限公司，渥曼青霉素、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)檢測試劑盒、原位細胞凋亡檢測試劑盒、免疫組化及Wester抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。動物人工呼吸機DH-40，浙江大學實驗儀器廠產品，八導生理記錄儀(日本:RM6000)，日本光電公司產品。

1.3 研究方法

1.3.1 分組 將50只SD雄性大鼠，隨機分為假手術組(SH組)、缺血再灌注組(I/R組)、白藜蘆醇預處理組(Res組)、白藜蘆醇預處理+渥曼青霉素組(Res+Wom組)、缺血再灌注+渥曼青霉素組(I/R+Wom組)五組，每組10只。

1.3.2 模型制備 SD健康大鼠術前禁食6 h，在1.55 mol/L烏拉坦5 mg/kg靜脈麻醉，仰臥位固定大鼠，標準Ⅱ導聯心電圖監測，連接氣管插管待開胸后連接人工呼吸機(潮氣量20 ml/kg，頻率50次/min)。在胸骨左緣0.5 cm處縱行切開第3～5肋，剪開心包，暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支，同時將一根直徑2 mm塑料管置于結扎線和冠狀動脈之間，拉近結扎線使塑料管壓迫引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖，以出現QRS波群高大增寬為結扎成功的標志。缺血45 min后，取出塑料管即再灌注，以QRS波群振幅逐漸回落為再灌注成功標志，進行再灌注120 min，假手術組的動物手術全過程與其他組相同，但只穿線不結扎冠脈〔2〕。

1.3.3 給藥方法 (1)SH組:冠狀動脈左前降支只穿線，不結扎，穿線時及第46分鐘取下穿線時由舌靜脈注入生理鹽水1 ml;(2)I/R組:結扎左冠狀動脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結扎時及再灌注前1 min由舌靜脈注入生理鹽水1 ml，余同SH組;(3)Res組:結扎左冠狀動脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結扎時及再灌注前1 min由舌靜脈注入白藜蘆醇20 mg/kg，余同SH組;(4)Wom+Res組:結扎左冠狀動脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結扎時及再灌注前1 min由舌靜脈注入白藜蘆醇20 mg/kg及渥曼青霉素，余同SH組;(5)Wom+I/R組:結扎左冠狀動脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結扎時及再灌注前1 min由舌靜脈注入1 ml生理鹽水及渥曼青霉素，余同SH組。

1.3.4 指標測定 (1)血流動力學監測:大鼠烏拉坦麻醉后，仰臥位固定，肝素化后(500 IU/kg)導管行右股動脈插管檢測血壓，經右側頸總動脈插管至左心室，連接至八道生理記錄儀，檢測血流動力學各項指標，并重點記錄左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左心室變化速率最大值(±dp/dtmax)在缺血前、缺血30、再灌注60、90、120 min幾個時間點的變化情況，并同步監測肢體Ⅱ導聯心電圖。(2)心肌組織NOS、NO含量的測定:NOS測定采用催化L-Arg比色法;NO采用硝酸酶還原法測定。(3)心肌凋亡細胞原位檢測:再灌注結束，迅速剪下心臟，置于冰的PBS液中洗凈殘血，分離左心室前壁，于4%的多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋。應用TUNEL凋亡測試試劑盒嚴格按照試劑盒說明書操作。光鏡下正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核為深淺不一的棕褐色，每張切片于缺血部位隨機選取8個高倍視野(400倍)，分別計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數并進行匯總，以凋亡心肌細胞數占心肌細胞總數的百分比作為凋亡指數(AI)。(4)心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達的免疫組化測定:每一標本取2個不同部位的切片各2張，采用鏈酶親和素-生物素-酶復合物(SABC)免疫組化檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達。以細胞質著棕黃色為陽性，用計算機圖像處理系統，每次隨機選10個視野，測定細胞陽性染色的OD值與陽性細胞百分比，計算蛋白陽性表達指數(PEI)，并計算Bax和Bcl-2的比值。(5)Western印跡測定Akt及p-Akt的蛋白表達:左心室心肌的缺血區，置于液氮中凍存后轉至－70℃存放。稱取凍存心肌樣品0.1 mg，冰浴，加入500 μl組織裂解液，冰浴勻漿，4℃，12 000 r/min 離心 10 min，收集上清50 μl應用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。余下上清加入4倍上樣緩沖液，封閉后100℃水浴10 min，－70℃保存。以每個樣品的總蛋白為20 μg上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠為5%，分離膠為12%，120 V/140 V)，BioBad干轉儀(≤90 mA)轉膜至PVDF，2%脫脂奶粉封1h，一抗體封閉4℃過夜。PBST(PBS+Tween-20，1/1 000，v/v)洗膜15 min ×3 次;二抗(1∶4 000)37℃孵育1 h(羊抗兔)，PBST漂洗后用增強化學發光法檢測蛋白表達，凝膠成像系統成像，應用 UVP凝膠圖像處理系統 Labwork4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.4 統計學方法 采 用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，血流動力學采用重復測定的方差分析，其余指標采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對LVSP、LVEDP、±dp/dtmax的影響 見表1。

2.2 各組心肌組織中的NOS、NO的含量 見表2。

表1 白藜蘆醇對LVSP、LVEDP、±dp/dtmax水平的影響(±s ，n=10)

表1 白藜蘆醇對LVSP、LVEDP、±dp/dtmax水平的影響(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與SH組比較:2)P＜0.05;與Res組比較:3)P＜0.05

SH組 I/R組 Res組 Res+Wom組 I/R+Wom組LVSP(mmHg)缺血前 114.44±7.65 113.55±7.05 114.17±6.82 113.97±6.59 112.98±6.65缺血30 min 113.27±7.43 100.71±7.192) 109.42±6.301)2) 101.05±5.782)3) 100.27±5.962)3)再灌注60 min 112.38±7.17 95.19±7.052) 104.75±6.751)2) 96.19±5.572)3) 94.16±5.152)3)再灌注90 min 111.75±7.01 91.34±6.972) 103.16±7.501)2) 92.65±5.672)3) 90.40±4.852)3)再灌注120 min 111.09±7.06 88.0±77.202) 101.53±8.191)2) 89.65±6.122)3) 86.99±4.732)3)LVEDP(mmHg)缺血前 4.44±1.58 4.52±1.36 4.09±1.80 4.15±1.13 4.42±1.35缺血30 min 4.81±1.60 9.47±1.382) 6.90±1.401)2) 8.71±1.292)3) 9.49±1.332)3)再灌注60 min 5.31±1.65 11.78±0.892) 7.96±1.771)2) 10.74±1.232)3) 12.17±1.422)3)再灌注90 min 5.60±1.59 12.72±0.922) 8.52±1.751)2) 11.66±1.262)3) 13.36±1.372)3)再灌注120 min 5.78±1.52 13.58±1.052) 9.05±1.671)2) 12.59±1.402)3) 14.51±1.042)3)dp/dtmax缺血前 4 192.46±303.35 4 165.52±256.17 4 104.45±270.47 4 208.00±217.06 4 081.65±276.152)3)缺血30 min 4 100.17±291.20 3 177.21±229.672) 3 665.85±266.251)2) 3 360.87±179.522)3) 3 084.91±274.312)3)再灌注60 min 4 049.17±293.54 2 887.65±266.352) 3 480.03±237.521)2) 3 074.13±141.452)3) 2 780.06±248.132)3)再灌注90 min 4 009.75±290.49 2 777.35±250.992) 3 422.85±231.991)2) 2 943.99±170.052)3) 2 681.93±259.872)3)再灌注120 m 3 960.75±280.06 2 672.18±247.502) 3 359.552±29.631)2) 2 842.00±143.622)3) 2 590.28±251.392)3)－dp/dtmax缺血前 －3 903.32±354.66 －3 843.79±292.58 －3 914.31±439.72 －3 933.29±362.35 －3 870.78±297.86缺血30 min －3 845.65±354.98 －3 061.15±279.702) －3 465.93±415.841)2)－3 098.50±242.432)3)－2 974.69±271.172)3)再灌注60 min －379 814±361.16 －2 925.75±289.912) －3 407.55±413.361)2)－2 974.37±247.842)3)－2 806.97±273.602)3)再灌注90 min －3 759.19±362.87 －2 847.64±302.352) －3 351.32±401.581)2)－2 902.35±240.762)3)－2 711.62±280.692)3)再灌注120 min －3 720.35±372.68 －2 775.87±300.852) －3 293.13±388.141)2)－2 831.53±248.162)3)－2 617.03±289.252)3)

表2 各組心肌組織中NOS、NO含量(±s ，n=10)

表2 各組心肌組織中NOS、NO含量(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與Res組比較:2)P＜0.05

組別 NO(μmol/L) NOS(U/ml)SH組36.60±3.42 21.18±2.75 I/R組 18.38±3.90 11.35±2.00 Res組 51.49±5.321) 30.95±3.031)Res+Wom組 20.52±4.102) 12.64±2.452)I/R+Wom組 15.29±2.892) 10.32±1.982)

2.3 各組大鼠心肌細胞AI比較 TUNEL法染色陽性的心肌細胞具有形態變圓或不規則、與周圍組織脫離、核固縮、染色質濃聚等典型的凋亡細胞的形態特征，主要位于心肌梗死區與非梗死區交界處，而在心肌梗死區和非梗死區內僅見極少數散在凋亡細胞。與I/R組〔(17.25±2.51)%〕相比，Res組AI顯著降低〔(10.03±2.25)%，P＜0.05〕;Wom+I/R組與 Res組相比，AI顯著升高〔(17.70±2.32)%，P ＜0.05〕，Wom+I/R 組與I/R組相比 AI無顯著差別(P＞0.05)。Res+Wom組 AI(16.17±2.86)%較I/R組及Res組明顯增高(P＜0.05)。

2.4 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達 Bcl-2和Bax蛋白表達的部位與凋亡細胞十分相似。與I/R組相比，Res組Bcl-2蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，Bax/Bcl-2低于 I/R組(P＜0.05)，加入PI3K-Akt信號通路的特異性阻斷劑渥曼青霉素后，與Res組相比，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，Bax/Bcl-2高于Res組。Res+Wom組與I/R組及Wom組相比，Bcl-2蛋白的表達無顯著差異(P＞0.05)，Bax/Bcl-2無顯著差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(±s ，n=10)

表3 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與SH組比較:2)P＜0.05;與Res組比較:3)P＜0.05

組別 Bcl-2 PEI(%)Bax PEI(%)Bax/Bcl-2 SH組14.1±1.8 15.4±3.1 1.5±0.5 I/R組 6.4±1.32) 14.7±2.52) 2.2±0.72)Res組 19.6±2.01)2) 13.5±2.71)2) 0.6±0.11)2)Res+Wom組 6.2±0.92)3) 13.6±2.6 2.1±0.52)3)I/R+Wom組 13.9±1.82)3) 15.2±2.82)3) 1.5±0.42)3)

2.5 各組總Akt及磷酸化Akt的表達量 各組總Akt差異無統計學意義(P＞0.05);與I/R組比較，Res組P-Akt蛋白表達明顯增加(P＜0.05);與 Res組比較，Res+Wom組和I/R+Wom組P-Akt蛋白表達水平降低(P＜0.05)。見表4，圖1。

表4 各組大鼠T-Akt及p-Akt蛋白的相對表達量比較(±s ，n=10)

表4 各組大鼠T-Akt及p-Akt蛋白的相對表達量比較(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與Res組比較:2)P＜0.05

組別T-Akt p-Akt I/R組3.8±1.8 0.82±0.32 Res組 3.7±2.2 1.98±0.431)Res+Wom組 3.9±2.1 0.62±0.222)Wom+I/R組 4.2±1.9 0.41±0.182)

圖1 各組大鼠總AKT及P-AKT的表達

3 討論

本實驗表明:LVSP、+dp/dtmax是與心肌收縮強度相關的指標。+dp/dtmax是對心肌變力性干預十分敏感的指標，在一定程度上受心率及前后負荷的影響并與其呈正相關。-dp/dtmax是心室收縮后左室內壓快速下降期的最大下降速率，反映左室的舒張功能，是心肌缺血早期心室舒張功能改變的敏感指標。若動脈壓不變或降低，-dp/dtmax降低則表示左室舒張功能異常。當左室舒張功能不全或回心血量增加，使LVEDP增高。心肌缺血期及再灌注期，上述各項心功能指標均表現出異常:左心室峰壓(LVSP)、左室等容期壓力最大變化速率(±dp/dtmax)呈現進行性下降，左室舒張末壓(LVEDP)不斷升高，給予白藜蘆醇后雖然不能使各項心功能指標恢復正常，但可以降低缺血后LVSP、±dp/dtmax的降低幅度;同時可以對抗LVEDP的升高，但是應用PI3K-Akt信號通路的特異性阻斷劑后，白藜蘆醇改善心功能的效果明顯降低(P＜0.05)。

研究發現，細胞凋亡是心肌缺血時心肌損傷的主要形式，心肌細胞的凋亡程度決定了心肌梗死面積的大小〔3〕。急性心肌梗死再灌注治療，在梗死灶周圍可見凋亡細胞的存在，因此抑制細胞凋亡，改善心肌細胞的功能狀態對于防治心肌缺血再灌注損傷，促進細胞存活有重要意義。白藜蘆醇預處理后，心肌組織中的NOS活性和NO含量上升，心肌細胞凋亡的數量顯著下降。NO的信號內轉導途徑可以與細胞凋亡的信號傳遞通路相互聯系，抑制 caspase-3裂解為 Bcl-2，從而減少細胞凋亡〔4〕。Bcl-2家族是主要的凋亡調控蛋白，包括 Bcl-2、Bax、Bcl-XL等，Bcl-2蛋白具有促進細胞生存，抑制細胞凋亡的作用，而Bax蛋白促進細胞凋亡，其中Bax與Bcl-2的表達比例是決定細胞是否凋亡的關鍵。心肌缺血再灌注損傷發生后，心肌細胞Bcl-2蛋白表達下降。本實驗提示白藜蘆醇減少心肌細胞凋亡的機制可能是通過上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax/Bcl-2的比值來實現的。NO還可以通過影響缺血再灌注過程中的炎癥反應過程，減少心肌細胞壞死和凋亡〔5〕。

研究證實，部分心肌保護的作用機制最終依賴于Akt的活化〔6〕。PI3K-Akt保護心臟的機制中涉及多種細胞內信號轉到介質和效應蛋白。活化的Akt能作用于它下游的多個靶點，如NOS〔7〕、B 細胞淋巴瘤/白血病 2(Bc1-2)家族〔8〕、糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)、天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、70 kd 核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)等，并可能最終通過減少線粒體通透性轉換孔(mPTP)〔9〕的開放，來改善線粒體能量的生成，保持線粒體外膜的穩定性，減少促凋亡因子的活化等，發揮保護心肌功能，抗凋亡的作用。再灌注時mPTP的開放是心肌損傷從可逆變為不可逆的標志，其開放的范圍決定再灌注損傷的程度。故延遲或阻斷心肌危險區mPTP的開放，可減輕心肌再灌注損傷。mPTP被認為是缺血∕再灌注損傷中細胞死亡的關鍵事件〔10〕。mPTP是PI3K-Akt信號通路上的重要靶點，PI3K-Akt信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路，是許多生命活動中的關鍵信號分子，PI3K-Akt介導的信號通路調節細胞的分裂、分化、凋亡等活動。

由此提示，白藜蘆醇對缺血再灌注心肌具有保護作用，能夠顯著抑制再灌注引起的細胞凋亡，而這種保護作用能被渥曼青霉素所阻斷，這種抑制可能與激活PI3K-Akt信號通路有關，而激活后的Akt具體是如何發揮保護效應，還需進一步研究。

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