內皮祖細胞磁性標記及MR示蹤在大鼠腦膠質瘤血管生成研究中的應用

陳偉志 (遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

膠質瘤是中樞神經系統常見腫瘤之一，生長速度快且復發性強〔1〕。腫瘤的生長和侵襲依賴于腫瘤的血管生長，而血管內皮祖細胞可參與腫瘤血管的新生〔2〕。因此，近年來對于內皮祖細胞參與腫瘤血管新生的過程有大量的研究。活體示蹤細胞是分子影像學的重要方法之一，能有效動態觀察機體的內部變化〔3〕。有研究使用超微超順磁性氧化鐵(USPIO)對干細胞進行標記并通過磁共振成像(MR)示蹤〔4〕，而內皮祖細胞磁性標記及MR示蹤并無相關報道。本研究采用USPIO進行大鼠腦膠質瘤血管生成過程中的內皮祖細胞磁性標記及MR示蹤。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 提取細胞動物選取雄性SPF級SD大鼠4只，體重(100±10)g;觀察動物選取雄性SPF級SD大鼠16只，體重(300±50)g;膠質瘤細胞株選取C6膠質瘤細胞株系。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的內皮祖細胞分離 首先將體重(100±10)g SD大鼠處死，提取骨髓來源的單核細胞，EGM-2培養基進行培養，條件為37℃，5%CO2濃度，培養14 d左右進行傳代，所得即為骨髓來源的內皮祖細胞。

1.2.2 USPIO-QDs雙標記 將25 μg/ml的磁性標記 USPIO與0.5 μg/ml的多聚賴氨酸混合，并與EGM-2培養基混勻，37℃下孵育24 h。將已磁性標記和未磁性標記的內皮祖細胞，加入2%亞鐵氰化鉀與6%鹽酸，進行Prussian blue染色，以觀察對內皮祖細胞的標記率。USPIO標記后，使用Qtracker565 cell labeling試劑盒對其進行量子點(QDs)熒光標記。將1 μl PBS緩沖液和波長為565 nm的QDs與0.2 ml EGM-2培養基混合，共同孵育24 h后，加入 Qtracker565 cell labeling培養液，37℃下孵育1 h。PBS清洗5次后，進行Prussian blue染色，并在光鏡下觀察。

1.2.3 腦膠質瘤模型的建立 使用腦立體定位儀對SD大鼠進行右側基底節區定位微注射，于冠狀縫前1 mm、中線右旁開3 mm、深 5 mm 注射 C6 膠質瘤細胞懸液 10 μl，速度 1 μl/min。

1.2.4 USPIO-QDs雙標記內皮祖細胞的移植 膠質瘤細胞注射大鼠5 d后，使用磁共振進行掃描并觀察瘤體生長情況，2 d后進行內皮祖細胞移植。將16只SD大鼠隨機分為2組，每組8只，實驗組通過尾靜脈注射USPIO-QDs內皮祖細胞懸液1 ml，對照組通過尾靜脈注射未標記的內皮祖細胞懸液1 ml。

1.2.5 MR示蹤腦膠質瘤內USPIO-QDs內皮祖細胞 分別于移植內皮祖細胞前2 d及移植后1、2、4 d后進行3.0 T MR掃描，主要包括 T1WI、T2WI、T2*map 掃描;T1WI掃描 TR=400 ms、TE=9.5 ms，T2WI 掃描 TR=2 000 ms、TE=46 ms，T2*map掃描 TR=120 ms、TE=2.8 ～35.4 ms。

1.2.6 大鼠腦組織切片熒光顯微鏡觀察 將USPIO-QDs雙標記移植細胞2、4 d后的大鼠鼠尾靜脈注射1 mg/ml德克薩斯紅標記的番茄凝集素0.5 ml，處死大鼠并進行腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腫瘤的新生血管生成。

2 結果

2.1 內皮祖細胞的USPIO-QDs標記 分別對USPIO磁性標記和未標記的內皮祖細胞進行Prussian blue染色，發現磁性標記的細胞胞漿內顯示藍色，而未標記細胞則無藍色顯示。使用波長為565 nm的QDs與內皮祖細胞進行孵育，隨后在熒光顯微鏡下進行觀察，發現內皮祖細胞顯示綠色熒光，發光位置在胞漿內部，說明USPIO-QDs可以對內皮祖細胞進行雙標記。見圖1。

圖1 內皮祖細胞的USPIO-QDs標記

圖2 MR示蹤對照組大鼠未磁性標記內皮祖細胞

2.2 MR示蹤磁性標記內皮祖細胞 在腦膠質瘤細胞接種7 d后，向實驗組和對照組的大鼠移植磁性標記和未標記的內皮祖細胞，分別對其進行MR掃描。由圖2可見，對照組大鼠右側基底節區顯示等T1長T2的信號，可見瘤體的強化，T2*map序列下腫瘤區見線狀針道信號，腫瘤組織在T2*map序列未見明顯異常的信號。

圖3顯示，實驗組大鼠磁性標記的內皮祖細胞移植前2 d，T1WI沒有顯示出明顯的異常信號，T2*map可見稍低信號，可能為針道信號;移植24 h后，T1WI右側基底節區呈現稍高的信號，T2WI和T2*map掃描下發現瘤周間斷線狀低信號;48 h及4 d后的磁共振掃描均可見瘤周的低信號存在，但低信號有消散的趨勢，說明內皮祖細胞遷移至腫瘤后開始增殖和分化。此結果顯示，磁性標記的內皮祖細胞向瘤體遷移的過程可以被MR所示蹤。

2.3 內皮祖細胞遷移顯示腫瘤新生血管生成 將注射德克薩斯紅標記的番茄凝集素后死亡的大鼠進行腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察發現內皮祖細胞遷移到腫瘤組織，并且分布在腫瘤的邊緣，顯示綠色熒光;紅色熒光顯示番茄凝集素標記的腫瘤新生血管。對圖片進行merge發現兩種熒光存在共定位，說明內皮祖細胞遷移至腫瘤后參與了新生血管的生成。Prussian blue染色顯示，QDs綠色熒光與Prussian blue陽性細胞處在同樣位置，說明此為USPIO-QDs雙標記的內皮祖細胞，進一步驗證了內皮祖細胞參與新生血管生成的可能性。見圖4。

圖3 MR示蹤實驗組大鼠磁性標記內皮祖細胞

圖4 內皮祖細胞遷移顯示腫瘤的新生血管生成

3 討論

研究發現，骨髓內部的內皮祖細胞可以分化為血管的內皮細胞〔5〕，在成體的血管新生中起重要的作用，成為近年來研究的熱點，不僅為血管新生的機制研究提供了新途徑，并為血管損傷、惡性腫瘤等的臨床治療提供了新思路和方法〔6〕。而血管生成在機體生理和病理過程中都起著重要作用〔7〕，研究發現腫瘤的生長和侵襲等都依賴于血管的生成，而內皮祖細胞則在腫瘤分泌產生的細胞因子作用下運動到外周血，參與腫瘤血管的生成〔8〕。因此，如何觀察內皮祖細胞參與腫瘤血管形成的過程是抑制腫瘤生長、侵襲的前提之一〔9〕。

隨著分子影像學的快速發展，活體觀察組織的變化成為目前研究的熱點，通過標記細胞進行MR示蹤對于觀察機體的代謝和變化有其獨特的優越性。目前標記干細胞的MR對比劑主要分為兩種:(1)順磁性對比劑，如常見的Gd螯合劑，通過產生T1正性對比效應對細胞進行標記;(2)單/多晶體氧化鐵為基礎的對比劑，較強的T2負性對比效應標記細胞，其優點在于穿透力較強，低濃度即可形成磁共振的對比〔10〕。USPIO即為其中常用的對比劑之一，能夠產生較大的順磁性，在自旋回波和梯度回波序列時形成低信號區而成像〔11〕。本研究說明磁性標記的內皮祖細胞向瘤體遷移的過程可以被MR所示蹤。

通過鼠尾靜脈注射德克薩斯紅標記的番茄凝集素，可確認雙標記的內皮祖細胞向瘤體遷移，并且分布在腫瘤的邊緣，而熒光共定位也顯示雙標記的內皮祖細胞參與了腫瘤血管的生成，因此，MR示蹤展示了內皮祖細胞從移植到參與腫瘤血管生成的中間過程，并有可能繼續觀察后續的進程。

綜上所述，USPIO對于內皮祖細胞磁性標記和MR示蹤是一種有效的標記物，而MR也是活體示蹤觀察USPIO標記的腦膠質瘤血管生成的有效手段。隨著MR發展速度的加快和更多示蹤劑的研發，無創、動態觀察越來越受到重視。在臨床觀察與基礎研究中，USPIO磁性標記和MR示蹤會得到越來越廣泛的應用。

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5 麥筱莉，滕皋軍，馬占龍，等.外周血內皮祖細胞磁探針標記及體外磁共振成像的實驗研究〔J〕.中華心血管病雜志，2007;35(9):838-43.

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