卡托普利預處理對急性心肌損傷大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響

周 艷 王 瑾 白 洋 鞠文博 顧 明 (北華大學基礎醫學院組胚教研室，吉林 吉林 0)

研究表明，在心肌細胞缺血缺氧導致心肌損傷的病理過程中，細胞凋亡參與了此過程〔1〕。因此，如何干預細胞凋亡成為研究熱點。卡托普利是一種血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)，用于高血壓的藥物治療已取得了良好效果。本實驗通過建立大鼠急性心肌損傷模型，部分模型給予卡托普利預處理，探討ACEI對心肌細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 卡托普利粉劑由常州制藥廠提供;Iso由美國Sigma公司提供;細胞凋亡檢測試劑盒由美國Roche公司提供;Fas兔多克隆抗體、FasL兔多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體及Bax兔多克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 實驗動物分組 60只健康的雄性Wistar大鼠，體重(180±15)g(由北華大學實驗動物中心提供)，普通飼料和水適應性喂養1 w后，按體重隨機分為3組，每組20只。Iso損傷組:腹腔內注射 Iso 5.0 mg·kg－1·d－1，連續 2 d;對照組:腹腔內注射生理鹽水5.0 mg·kg－1·d－1，連續2 d;Cap預處理組:腹腔內注射 Iso 5.0 mg·kg－1·d－1，連續 2 d。Cap 預處理組注射前1 d給予卡托普利100mg·kg－1·d－1灌胃，連續3 d;Iso損傷組和對照組均在注射前1d給予生理鹽水3ml灌胃，連續3 d。末次注藥后24 h，拉頸處死大鼠，按實驗要求取材。

1.3 觀測指標及實驗方法

1.3.1 TUNEL方法檢測心肌細胞凋亡 開胸取大鼠心臟后，沿右室游離壁正中心臟長軸切開，取1/2心臟用4%多聚甲醛常溫下固定24 h，常規石蠟包埋，并制成5 μm厚切片，用于檢測細胞凋亡，操作步驟按試劑盒說明進行，光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 免疫組化方法檢測Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白表達 取石蠟切片標本進行免疫組化及DAB顯色，操作步驟按試劑盒說明進行，光學顯微鏡下觀察，細胞質中出現棕黃色染色為陽性。

2 結果

2.1 心肌細胞凋亡檢測 正常的心肌細胞核被染成藍色，凋亡的心肌細胞核被染成棕褐色。根據顯色濃淡和顆粒多少將染色強度分為－～。凡達到陽性者都認為是凋亡細胞。本實驗顯示，對照組大鼠心肌組織內僅偶見凋亡細胞;Iso損傷組和Cap預處理組大鼠心肌組織內均可見到大量的凋亡細胞，但Cap預處理組與Iso損傷組比較，心肌細胞凋亡指數明顯減少，兩組間有顯著差異(P＜0.01)。見表1和圖1。

表1 大鼠心肌凋亡指數、凋亡相關基因的表達(±s)

表1 大鼠心肌凋亡指數、凋亡相關基因的表達(±s)

與Iso損傷組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與對照組比較:3)P＜0.01

組別 n 凋亡指數(%)Fas蛋白表達指數(%)FasL蛋白表達指數(%)Bcl-2蛋白表達指數(%)Bax蛋白表達指數(%)對照組20 0.99±0.39 2.94±0.60 0 5.60±0.78 6.08±0.78 Iso損傷組 30 12.72±2.943) 17.17±2.223) 8.50±1.44 4.52±0.473) 11.27±1.023)Cap預處理組 20 6.13±1.151) 12.96±1.411) 6.40±0.641) 5.34±0.791) 10.58±1.032)

2.2 免疫組化方法檢測Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白表達 圖2～圖5可見，Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白免疫組化陽性反應均為呈現黃或棕黃色顆粒，在胞質中表達，三組中各個蛋白的表達強度不一，與心肌細胞凋亡發生部位基本一致。表1顯示:對照組Fas、Bax蛋白表達水平較低，Bcl-2有一定程度表達，未見FasL蛋白陽性表達;Iso損傷組與對照組比較，Fas、FasL和Bax蛋白表達增加，Bcl-2表達降低，組間有顯著性差異(P＜0.01);Cap預處理組與Iso損傷組比較，Fas、FasL和Bax蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2表達增高、組間有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)。

圖1 各組心肌細胞凋亡情況(×66)

圖2 各組心肌細胞Fas蛋白表達(×66)

圖3 各組心肌細胞FasL蛋白表達(×66)

圖4 各組心肌細胞Bcl-2蛋白表達(×66)

圖5 各組心肌細胞Bax蛋白表達(×66)

3 討論

本實驗用異丙基腎上腺素成功制造出缺血性心肌損傷的動物模型，其病理特點、電生理、心肌酶學等變化與缺血性心臟病都很類似。細胞凋亡的發生受一系列基因調控，目前已知的促凋亡基因有 Fas、Bax、ICE、ICH-1、iNOS 及 wp53 基因，抗凋亡基因有Bcl-2、Bcr/Abl、CrmA、ras及mp53基因等。在心肌梗死時遠離梗死區的正常心肌細胞很少發生細胞凋亡;在缺血區和正常區的分界處有凋亡細胞的存在，而在心肌壞死的中心區域混有大量的凋亡細胞，這說明也許心肌細胞的死亡是以細胞凋亡開始的，凋亡細胞增加，直到造成細胞壞死〔2〕。本研究表明，Iso損傷組與對照組比較，心肌細胞凋亡指數明顯增加;Fas、FasL和Bax蛋白的表達明顯增加，Bcl-2表達明顯減少，表明Fas、FasL、Bax和Bcl-2基因參與了異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷過程中心肌細胞凋亡進程的調控。Fas基因的表達，主要是通過Fas-FasL-FADD-Caspase-8-Caspase-3的凋亡信號轉導級聯系統，經Caspase-8途徑鏈式激活，最終導致細胞凋亡，這條通路稱為細胞凋亡的外通路。線粒體是維持細胞正常功能的重要細胞器，線粒體內含有的細胞色素C則是參與氧化磷酸化的重要成分。心肌細胞是體內線粒體含量最豐富的細胞，缺血可促進線粒體釋放細胞色素C，細胞色素C首先與凋亡活化因子-1(Apaf-1)結合，激活Caspase-9，并最終激活Caspase-3，引起細胞凋亡，這條通路稱為細胞凋亡的內通路。線粒體釋放細胞色素C的過程主要受Bcl-2家族的調控，其中Bcl-2和Bax在線粒體表面分別發揮相反的作用。Bcl-2可抑制線粒體膜通透性轉變孔的開放，減少細胞色素C的釋放，并促使氫離子從線粒體中泵出，并提高線粒體的鈣緩沖能力，阻止Caspase-9凋亡激活途徑，抑制細胞凋亡。而Bax可促進線粒體膜通透性轉變孔的開放，增加細胞色素C的釋放從而拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。

與Iso損傷組比較，Cap預處理組Fas、FasL、Bax蛋白的表達減少，Bcl-2蛋白的表達增加，提示卡托普利在心肌組織損傷過程中參與了細胞凋亡相關基因的的調控。有研究發現，卡托普利預處理可誘導hsp70的合成。hsp70是細胞保護性蛋白，能促進新生多肽鏈的正確折疊，協助新生蛋白質的合成和修復損傷的蛋白質，維持蛋白質合理構象;并能激活某些酶的作用，以維護細胞的功能和生存〔3～5〕。Klein 等〔6〕用 hsp70 基因轉染RAW 264.7鼠巨噬細胞，發現hsp70過度表達的細胞中細胞色素C胞漿轉位以及Caspase-9和caspase-3的活化明顯降低，認為hsp70干擾了細胞色素C從線粒體的釋放，這可能是hsp70抑制細胞凋亡的機制之一;另外，缺血性心肌損傷可導致Bcl-2蛋白的變性，hsp70可通過對變性的Bcl-2蛋白進行修復及防止其降解，來恢復其凋亡抑制功能。Gordon等〔7〕發現上調hsp70表達能明顯減少Bax蛋白的表達，Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定促進或抑制細胞凋亡強度的關鍵因素。王萬銀等〔8〕的研究認為，hsp 70可能通過抑制caspase-8和caspase-3的活力來降低Fas通路的活化，減輕心肌細胞凋亡。本研究表明，卡托普利預處理可通過減少心肌細胞凋亡及降低凋亡相關基因的表達有關，來發揮心肌保護作用。

1 Krijnen PA，Nijmeijer R，Meijer CJ，et al.Apoptosis in myocardial ischemia and infarction〔J〕.J Clin Pathol，2002;55(11):801-11.

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3 López N，Díez J，Fortuo MA.Characterization of the protective effects of cardiotrophin-1 against non-ischemic death stimuli in adult cardiomyocytes〔J〕.Cytokine，2005;30(5):282-92.

4 陳 輝，陸 超，周國平，等.心肌營養素-1在窒息新生大鼠心肌和外周血血漿中的表達及神經調節蛋白-1的干預作用〔J〕.實用兒科臨床雜志，2008;23(14):1065-7.

5 顧 明，白 冰，張 旭，等.大鼠急性心肌損傷與CT-1 mRNA相關性的實驗觀察〔J〕.中國地方病學雜志，2006;25(1):22-4.

6 Klein SD，Brune B.Heat-shock protein 70 attenuates nitric oxide-induced apoptosis in RAW macrophages by preventing cytochrome c release〔J〕.Biochem J，2002;362(6):635-41.

7 Gordon SA，Hoffman RA，Simmons RL，et al.Induction of heat shock protein 70 protects thromocytes against radiation-induced apoptosis〔J〕.Arch Surg，1997;132(12):1277-82.

8 王萬銀，弓景波，吳淑慶，等.預熱誘導心肌細胞表達Hsp70對Fas通路活化后細胞凋亡變化的研究〔J〕.中國應用生理學雜志，2005;21(3):309-14.