厄洛替尼對核轉錄因子κB表達以及單核細胞凋亡的影響

孫曉東 王 原 代素梅 張紹華 王海波 楊照環 劉華群 侯秀珍 于翠萍(唐山市工人醫院腫瘤科，河北 唐山 063000)

單核細胞是機體先天性免疫應答和獲得性免疫應答的重要成員之一〔1〕。單核細胞的異常發育，必然導致機體免疫系統功能和機體內環境紊亂，引發多種疾病。骨髓造血干細胞分化為單核細胞受多種細胞因子影響，其中表皮生長因子(EGF)是骨髓造血干細胞分化的重要生長因子，可以促進成纖維細胞、間充質細胞和腫瘤細胞產生一些趨化因子，尤其是單核細胞趨化因子(MCP-1)蛋白。作為單核巨噬細胞特異性的趨化因子，MCP-1在誘導單核細胞成熟、趨化以及參與炎癥和腫瘤組織浸潤等生物學效應中發揮著重要的作用〔2〕。厄洛替尼作為EGF受體的特異性抑制劑已經在臨床中廣為使用，多數癌癥患者從中受益。然而，厄洛替尼是否能夠通過抑制EGF對單核細胞的作用，從而改變單核巨噬細胞的功能活性是本研究擬解決的問題。

1 材料與方法

1.1 單核細胞培養 把單核細胞系RAW264.7(購自美國ATCC)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，懸浮于含10%小牛血清的 RPMI1640培養基中，37℃ 5%CO2條件下培養2 h，收集未貼壁細胞置于新的培養瓶中，調整細胞密度至1×106/ml，用于單核細胞的傳代培養。將離體培養的單核細胞分為四組:空白對照組、EGF處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯合厄洛替尼處理組。EGF、厄洛替尼作用濃度分別為 10 ng/ml、4 μmol/L。聯合組為EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖變化 調節RAW264.7細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板中，每組設6個復孔，轉染方法和轉染后處理同前。轉染后48 h各組棄培養液，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞抑制率 =〔(空白對照組 OD值－各實驗組OD值)/空白對照組OD值〕×100%。

1.2.2 單核細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀DNA倍體分析法。取對數生長期的以上四組細胞，胰酶消化，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混勻，4℃固定30 min。再以1 000 r/min離心5 min，棄培養液，用PBS洗2次，置于4℃室溫避光反應15 min;在1 h內上流式細胞儀檢測，結果用Muticycle軟件系統進行分析，實驗重復3次。

1.2.3 Western印跡檢測核轉錄因子(NF)-κB的p65蛋白水

平 收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后－80℃保存備用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，完畢后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶液，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫反應1 h，目標蛋白質用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。計算機掃描，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白做參照，分析處理。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，結果數據用±s表示，組間均數比較用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 厄洛替尼對單核細胞生長的抑制情況 厄洛替尼對人單核細胞的生長具有抑制作用，不同濃度的厄洛替尼對單核細胞均有抑制性，其抑制作用具有明顯的劑量和時間依賴性，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 厄洛替尼作用單核細胞的抑制率(%)

2.2 厄洛替尼對細胞凋亡的影響 空白對照組、EGF處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯合厄洛替尼處理組的凋亡率分別為5.43% ±0.67%、12.1% ±1.56%、25.3% ±0.37%和33.2% ±1.37%，析因設計方差分析各組間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 Western印跡結果 厄洛替尼可以顯著地抑制單核細胞分泌NF-κB，進而誘導單核細胞的凋亡。

3 討論

單核細胞的分化發育是一個復雜的生命過程，其中涉及多種信號途徑的協同和調控。某些細胞因子，如白細胞介素(IL)可刺激多能干細胞向髓樣干細胞分化〔3〕，而巨噬細胞集落因子(GM-CSF)能促使髓樣干細胞進一步分化為單核細胞〔4〕。外周血單核細胞在GM-CSF和IL-4的共同作用下可以在體外分化為樹突細胞，Chomarat等〔5〕研究發現IL-6可以抑制單核細胞向樹突細胞方向分化，同時促進其向巨噬細胞分化。在腫瘤發展過程中，炎癥性單核巨噬細胞浸潤起著一定作用。而目前發現給予厄洛替尼處理后，EGF對單核細胞的凋亡具有抑制作用，并在抑制單核細胞凋亡進而抑制單核巨噬細胞趨化過程中得以體現，從一個較新的角度提示厄洛替尼對EGF受體相關腫瘤浸潤和轉移的抑制作用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的思路和探索。

本研究結果顯示，厄洛替尼抑制單核細胞凋亡，通過抑制其分泌NF-κB因子，進而誘導單核細胞的凋亡。NF-κB發生核轉位，從而啟動多種基因轉錄。NF-κB因子是一種重要的細胞內信號因子，由P50和P65組成二聚體，調節許多與細胞生長和分化相關的基因表達〔6〕。在多種人類腫瘤中NF-κB促進腫瘤的惡性化是多方面的，其調控的靶基因參與腫瘤的浸潤、轉移、血管生成和腫瘤的抗凋亡〔7〕。NF-κB調節單核細胞的經典途徑為，未激活的NF-κB以P50/65-IκBα二聚體形式儲存于胞漿中。在外界條件刺激下，IκBα發生磷酸化降解，導致P50/65核定位序列(NLS)暴露〔8〕。在腫瘤發展過程中，NF-κB可以促進腫瘤轉移和炎癥性單核巨噬細胞浸潤。而給予厄洛替尼處理后，EGF對單核細胞分泌NF-κB具有抑制作用，這種作用在單核巨噬細胞趨化過程中得以體現。

本研究表明，厄洛替尼可以有效抑制單核細胞凋亡和遷移，進而調控單核細胞的分化。這一結果闡明了厄洛替尼對單核細胞分化的調控，進一步從細胞水平為其抗腫瘤浸潤和轉移的抑制作用提供依據。

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