MRL/lpr小鼠胸腺異位基因的表達

魏旋子 劉聲茂 田 庚 于宏宇 盧雪紅 羅 萍 (吉林大學第二醫院腎病內科，吉林 長春 3004)

生理狀況下胸腺基質細胞(皮質及髓質上皮細胞、樹突細胞等)可表達多種組織特異性基因，稱為異位基因表達。胸腺髓質上皮細胞(mTECs)是異位基因表達的最重要細胞，成熟mTECs幾乎表達所有異位基因〔1〕。而異位基因表達誘導耐受是通過自身反應性T細胞的克隆無能和克隆清除實現的〔2，3〕。系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的器官非特異性自身免疫病，臨床表現為多系統、多器官損害。檢測MRL/lpr狼瘡小鼠〔4〕胸腺異位基因表達的情況為探討其與中樞耐受的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 尿蛋白及抗核抗體的檢測 對照組BAB/C小鼠 (19～21 g)購自吉林大學實驗動物中心;模型組MRL/lpr狼瘡小鼠(30～37 g)購自北京斯萊克動物中心。每組5只，均為雌性，鼠齡10周齡。用尿蛋白試紙條蘸取小鼠尿液，與標準尿液分析試紙條的顏色進行比較，結果以“－～”表示。抗核抗體檢測采用間接免疫熒光法，按試劑盒(德國歐蒙公司)說明操作，熒光二抗為FITC標記山羊抗小鼠IgG，于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2 胸腺上皮的分離 無菌取胸腺，剪碎后用DMEM沖洗去除游離胸腺細胞，Trizol凍存胸腺上皮備RNA提取〔5〕。

1.3 異位基因表達的檢測 提取Trizol凍存的胸腺上皮總RNA。cDNA逆轉錄采用Takara的AMV RTase，按說明書進行操作。通過預實驗確定PCR反應條件和最適循環數，以保證PCR產物量與起始cDNA量呈線性相關。組織特異性基因唾液蛋白2(SP2)、甲狀腺球蛋白(TG)，及組織非特異性基因組織蛋白酶L(CTSL)和C反應蛋白(CRP)。以β-actin作為內參照，RT反應條件為30℃ 10 min、45℃ 30 min、5℃ 5 min。PCR引物序列引自文獻〔6〕，由上海生工合成，引物序列見表1，PCR反應體系為 25 μl，包括 Ex Taq 0.125 μl、10 × ExTaq 緩沖液2.5 μl、dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)、Distilled Water 14.5 μl、正、反義引物各 0.5 μl(20 μmol/L)、cDNA 5 μl。RT-PCR 產物的檢測:取5 μl PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，含0.5 μg/ml溴乙啶。凝膠掃描成像系統記錄電泳結果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)圖像分析軟件分析光密度值，以異位基因/β-actin光密度比值表示異位基因表達水平，以100 bp DNA ladder V(鼎國)相對分子質量為標準。

表1 PCR引物名稱、序列和產物大小

1.4 異位基因相關器官的病理 分離小鼠唾液腺，用100 ml/L甲醛固定后，依次進行系列梯度脫水、浸蠟、包埋及切片(厚度2 μm)后，按常規進行HE染色，于光鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 小鼠尿蛋白檢測結果 對照組尿蛋白均呈陰性，模型組中1只+、4只。

2.2 抗核抗體檢測結果 對照組均為陰性，模型組抗核抗體滴度為1∶320 ～1∶1 000。見圖1。

2.3 異位基因表達水平 MRL/lpr組胸腺中CTSL、SP2、TG和CRP四種異位基因的表達均明顯減弱(圖2)，Balb/C和MRL/lpr組 CTSL、SP2，TG、CRP四種異位基因表達分別為〔(148.44±16.5)vs(93.44 ±11.9)〕，〔(30.67 ±3.5)vs(5.63 ± 2.2)〕，〔(72.41 ± 10.8)vs(21.06 ± 3.6)〕，〔(90.82±11.9)vs(40.23±6.4)〕。

2.4 唾液腺病理 MRL/lpr狼瘡小鼠唾液腺有大量的炎細胞浸潤，而BAB/C小鼠未見炎細胞浸潤。見圖3。

圖1 抗核抗體檢測結果(免疫熒光，×200)

圖2 胸腺異位基因相關蛋白的表達(Western印跡)

圖3 各組小鼠唾液腺病理改變(Masson，×400)

3 討論

中樞耐受是指在中樞免疫器官中，識別自身抗原的T、B細胞克隆被清除進而形成自身耐受。中樞免疫器官是免疫細胞發生、分化、成熟的場所，包括骨髓及胸腺。其中T祖細胞經血液循環到達胸腺，在胸腺中經過陽性和陰性的選擇后分化為成熟T細胞進入外周循環。如果在胸腺中出現選擇異常，則有可能出現中樞耐受缺陷。而目前認為，異位基因表達可通過自身反應性T細胞的克隆清除、克隆無能或形成調節性T細胞誘導中樞免疫耐受〔1〕。

SLE是一種常見的非特異性自身免疫病，血清中存在以抗核抗體為主的大量抗體，但病因和發病機制尚未完全闡明。其中MRL/lpr小鼠是常用的SLE動物模型之一，其癥狀與人類SLE相似，包括顯著的血清自身抗體、免疫復合物腎小球腎炎、血管炎等。含有與細胞自發性程序性死亡有關的Fas基因隱性突變，出現淋巴細胞增生，導致T細胞增生，全身淋巴器官腫大。本文中四種與發病有關的SP2、TG、CTSL和CRP異位基因表達量明顯降低，這會導致自身反應性T細胞逃避陰性選擇而到外周進而出現中樞耐受，針對SP2的自身反應性T細胞會導致唾液腺的損傷而出現唾液腺炎的改變。模型組其他異位基因表達降低與器官損害的相關性還需進一步研究。

盡管多種機制〔7〕參與SLE的發病，然而實驗結果表明胸腺基質細胞的組織特異性抗原如SP2、TG、CTSL和CRP表達水平的降低參與MRL/lpr的發生及發展，這不僅完善了SLE的發病機制，如何調控異位基因的表達也將成為治療的契機。

1 Derbinski J，Gabler J，Brors B，et al.Promiscuous gene expression in thymic epithelial cells is regulated at multiple levels〔J〕.J Exp Med，2005;202(1):33-45.

2 Husbands SD，Schonrich G，Arnold B，et al.Expression of major histocompatibility complex class I antigens at low levels in the thymus induces T cell tolerance via a non-deletional mechanism〔J〕.Eur J Immunol，1992;22(10):2655-61.

3 Klein L，Klein T，Ruther U，et al.CD4 T cell tolerance to human C-reactive protein，an inducible serum protein，is mediated by medullary thymic epithelium〔J〕.J Exp Med，1998;188(1):5-16.

4 張 飚，唐福林.系統性紅斑狼瘡模型鼠MRL/lpr研究進展〔J〕.中華風濕病學雜志，2006;2(10):110-3.

5 陳繼冰，于春雷，劉 陽，等.STZ誘導小鼠糖尿病模型中胸腺異位基因表達的研究〔J〕.免疫學雜志，2006;22(1):37-9.

6 Derbinski J，Schulte A，Kyewski B，et al.Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self〔J〕.Nat Immunol，2001;2(11):1032-9.

7 He CY，Lu XH，Luo P，et al.Therapeutic effect of leflunomide on the development of experimental lupus nephritis in mice〔J〕.Rheumatol Intern，2012;3(32):633-8.