乳化異氟醚對老齡大鼠術后認知功能的影響

楊建生 潘 娟 (河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450000)

術后認知功能障礙(POCD)表現(xiàn)為定向力、學習、記憶、注意等方面的認知功能下降，術后人格改變、記憶受損、社交及認知能力降低，多見于老年人〔1〕。環(huán)腺苷酸應答元件結合蛋白(CREB)作為轉錄因子，在長時程記憶的過程中起重要作用〔2〕。突觸素P38可調節(jié)神經遞質釋放、參與突觸囊泡的導入、轉運、再循環(huán)和突觸發(fā)生，是學習記憶過程中的重要分子之一〔3〕。作為新型的靜脈全麻藥，乳化異氟醚可直接靜脈應用，在治療指數(shù)相似的前提下，其麻醉誘導作用及復蘇均優(yōu)于丙泊酚〔4〕，具有良好的臨床應用前景，但對于其術后認知功能的影響尚缺乏認識。本研究選用老齡SD大鼠做麻醉模型，利用Morris水迷宮的記憶提取測試〔5〕，研究乳化異氟醚對大鼠記憶提取及CREB和P38表達的影響，探討乳化異氟醚對記憶認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康SD雄性老年大鼠36只，體重為400～500 g(鄭州大學實驗動物中心提供)。隨機分為空白對照組(C組，n=6)、30%脂肪乳組(E組，n=6)、8%乳化異氟醚組(EI組，n=24)，EI組共分 4個亞組(即 EI麻醉蘇醒后 6 h、24 h、72 h、7 d 組，每組 n=6)。

1.2 藥品和儀器 8%乳化異氟醚(委托鄭州大學藥理學實驗室配制，以30%脂肪乳為載體，配制成液態(tài)異氟醚120 mg/ml、濃度為8%的制劑);30%脂肪乳(批號:20110509，西安力邦制藥有限公司);大鼠Morris水迷宮測試儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 麻醉前全部大鼠另加10只(候補)行Morris水迷宮實驗，其中定位航行實驗持續(xù)7 d，每天3次，在一圓形

水池中注滿水，水池均分為4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，將平臺置于Ⅰ象限，水面高于平臺1～2 cm，將大鼠面向池壁按東、南、西、北4個入水點分次放入水中，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期)另加;第7天結束后2 h行探索實驗，去除平臺，從將大鼠從Ⅲ象限投入水中將大鼠放入水中，記錄大鼠120 s內在平臺象限停留時間，考察其對原平臺的記憶。平臺象限游泳的距離百分比超過30%表明參與大鼠形成了對平臺位置的空間記憶，以此為大鼠入選標準。不及格者或多余者剔除。水迷宮實驗于每日16時至20時完成，此后，各組行尾靜脈穿刺，EI組靜脈注射8%乳化異氟醚1.5 ml/kg。EI組以大鼠前爪翻正反射消失，夾尾反射消失為麻醉成功標準。E組給予等容量30%脂肪乳;C組給予等容量生理鹽水。

1.3.2 行為學測試 停藥到翻正反射恢復即表示麻醉蘇醒。C組、E組于給藥后6 h再次進行水迷宮實驗，EI分別于麻醉蘇醒后6 h、24 h、72 h、7 d時各取6只大鼠行水迷宮實驗，每次定位航行實驗結束后2 h行探索實驗。記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 CREB(p-CREB)及突觸素P38的表達測定 行為學測試結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)后頸椎脫臼法處死大鼠，取海馬組織200 mg，各100 mg低溫狀態(tài)下加入裂解液(1 mg∶4 μl)進行組織裂解，勻漿，離心等操作后提取上清液，此即為全蛋白提取物，BCA法進行蛋白定量。將全蛋白提取物進行電泳，轉膜，封閉后，置于相應的一抗稀釋液4℃緩慢搖動孵育過夜。洗膜，置于相應的二抗稀釋液中，室溫孵育1 h。洗膜，孵育底物，化學發(fā)光顯色。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用多組定量資料的單因素方差分析LSD法。

2 結果

2.1 各組水迷宮實驗結果 E組與C組間各指標比較無差異(P＞0.05);與C組比較，EI組麻醉蘇醒后6 h、24 h時逃避潛伏期延長，平臺象限停留時間縮短;72 h、7 d時各指標變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與麻醉蘇醒后6 h時比較，72 h、7 d時逃避潛伏期縮短及平臺象限停留時間延長(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及平臺象限停留時間比較(n=6，±s)

表1 各組大鼠逃避潛伏期及平臺象限停留時間比較(n=6，±s)

與C組比較:1)P＜0.01;與麻醉蘇醒后6 h時比較:2)P＜0.05

組別 逃避潛伏期(s) 平臺象限停留時間(s)C組 處理后6 h 14.67±2.4 50.33±3.98 E組 處理后6 h 14.00±1.4 48.01±6.23 EI組麻醉蘇醒后6 h 19.00±1.41) 40.00±2.371)麻醉蘇醒后24 h 17.67±2.421) 39.67±2.161)麻醉蘇醒后72 h 14.00±1.792) 47.50±4.512)麻醉蘇醒后7 d 12.67±1.032) 50.02±5.292)

2.2 各組CREB、突觸素P38表達 E組與C組間各指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與C組比較，EI組麻醉蘇醒后6 h、24 h時海馬CREB(p-CREB)及突觸素P38表達下調(P＜0.05);72 h、7 d時各指標變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與麻醉蘇醒后 6 h時比較，EI組 72 h、7 d時海馬組織 CREB(p-CREB)及突觸素P38含量增高(P＜0.05)。Western印跡結果見圖1，圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)p-CREB蛋白電泳圖

圖2 各組大鼠海馬區(qū)P38蛋白電泳圖

3 討論

POCD屬術后中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為記憶受損或人格改變，可伴有語言總結能力降低和行為異?！?〕。老年患者組織器官發(fā)生退行性改變，對圍術期傷害性刺激引起的應激反應的調節(jié)能力降低，是發(fā)生POCD的高危人群〔7〕，隨著接受手術者人口基數(shù)增加，發(fā)病人數(shù)逐年增高，臨床工作不容忽視。

已證實EI靜脈應用可產生確切而可逆的麻醉作用，兼具靜脈和吸人揮發(fā)性麻醉藥的優(yōu)點，在治療指數(shù)相似的情況下，EI的麻醉誘導與麻醉復蘇均優(yōu)于丙泊酚〔8〕，且乳化異氟醚在大鼠靜脈注射時的ED50和LD50分別為:0.07和0.22 ml/kg，用量小〔4〕，故EI具有良好的臨床應用前景。但其對術后認知功能的影響缺乏進一步的研究。

Morris水迷宮是研究腦學習記憶機制的一種實驗手段，其中定位航行實驗可反映動物的學習記憶能力，空間搜索實驗反映動物的空間聯(lián)想能力及回憶探究能力。由于C組和E組在4個時間點的行為學差異無統(tǒng)計學意義，遵照動物實驗“少量”的原則，在后續(xù)蛋白檢測中未進一步分組。同時參照大鼠異氟醚麻醉后 POCD的研究結果，設置4個時間點;用藥劑量(1.5 ml/kg)〔8〕。本研究提示，乳化異氟醚麻醉后可引起認知功能、回憶提取功能下降，但其影響呈一過性，72 h后基本恢復。認知功能是大腦高級功能，包括學習記憶的形成及記憶的提取。CREB與空間記憶的形成密切相關，并在神經元的可塑性和大腦長期記憶的形成中起重要作用。Guzowski等〔9〕在轉基因小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，CREB在恐懼記憶的鞏固及提取再鞏固的過程起重要作用。

突觸素P38是一種鈣結合糖蛋白，其構成突觸囊泡特異性的膜通道，參與囊泡的轉運和遞質的釋放，與突觸可塑性關系密切，在培養(yǎng)的海馬神經元突觸發(fā)育時伴隨突觸素P38高水平表達〔10〕。同時突觸素還是突觸傳遞效能的反映〔12〕，因而突觸素蛋白可以反映突觸的信息傳遞及遞質釋放，亦可反映神經傳遞的增減及認知功能的強弱〔11，12〕。本研究中，EI組 6 h、24 h認知功能、回憶提取功能降低，同時伴有CREB、P38表達的減低，印證了CREB在記憶提取過程中的作用以及突觸素P38在記憶形成和遞質傳遞中的作用，并在分子生物學層面驗證了麻醉后大鼠認知功能的下降;72 h、7 d時行為學測試成績較6 h、24 h相比有提升，與C組相較，無明顯差異，同時CREB和P38的表達量有增加，進一步明確了CREB、P38在認知過程中的作用，并提示乳化異氟醚所致POCD呈一過性，麻醉結束后72 h可恢復，為可逆性改變。

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8 周建新，羅南富，劉 進，等.序貫法測定乳化揮發(fā)性麻醉藥在大鼠靜脈誘導中的半數(shù)有效量〔J〕.麻醉與監(jiān)護論壇，2002;9(4):24-6.

9 Guzowski JF，Mc Gaugh JL.Antisense oligodeoxynucleotide-mediated disruption of hippocampal cAMP response element binding protein levels impairs consolidation of memory for water maze training〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(6):2693-8.

10 Nathan PJ，Cobb SR，Lu B，et al.Studying synaptic plasticity in the human brain and opportunities for drug discovery〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2011;11(5):540-8.

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