丹酚酸B對老年性癡呆模型的保護作用

程繼明 周翔魚 白向東 (銀川市第一人民醫院神經內科，寧夏 銀川 750001)

老年性癡呆(AD)是老年人中常見的神經退行性疾病，80歲以上老年人高發，病人出現認知障礙和學習記憶能力的損傷。AD發病機制尚不明確，目前有氧自由基學說、β樣淀粉蛋白沉積學說、Tau蛋白過度磷酸化學說等。AD主要病理改變為老年斑、神經纖維纏結和突觸丟失。自由基造成的氧化損傷也參與了AD發病過程〔1〕。老年人自由基清除能力下降，導致出現大量自由基，從而損傷細胞功能，加速AD發病。過氧化氫酶(CAT)和谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-PX)兩者協同對抗體內自由基，保護細胞功能和結構完整功能。丹酚酸B(Sal B)是中藥丹參的主要成分，以往研究表明Sal B具有抗氧化、抗β淀粉樣蛋白導致的細胞毒性〔2〕。Sal B還能促進血管再生，促進神經發生。以往報道顯示Sal B可以保護血管性癡呆動物模型大鼠的學習記憶能力和血管功能。但是Sal B在AD模型中的作用尚不明確。本實驗旨在觀察Sal B在東莨菪堿模型的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠購買自華中科技大學協和醫院動物實驗中心。大鼠隨機分成空白組、模型組和治療組。模型組大鼠腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg，治療組腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg，36 mg/kg Sal B溶于1 ml蒸餾水中灌胃?？瞻捉M給予相應的生理鹽水處理，每天處理一次，連續處理7 d。

1.2 試劑 東莨菪堿購買自天津市福順化學試劑廠。CAT試劑盒、GSH-PX測試盒購買自南京建成生物工程研究所。Western印跡所用抗體購買自Abcam公司。

1.3 Morris水迷宮 SD大鼠造模1 w后進行水迷宮實驗，水迷宮由一個內壁及底部為黑色的圓柱形水池構成，直徑150 cm，高50 cm，分為4個象限，第Ⅲ象限中央放一個30 cm的透明有機玻璃平臺，迷宮及平臺位置整個實驗過程中均保持不變。水溫控制在23℃。大鼠從水池邊上每個象限中點放入水池，軟件記錄大鼠在60 s內找到第Ⅲ象限內平臺的時間，即潛伏期。讓大鼠在平臺上放置20 s，連續訓練6 d，第7天撤除平臺檢測大鼠的潛伏期和穿越平臺的次數。

1.4 免疫印跡 10%SDS-PAGE膠電泳，濕式轉移法將膠里面的蛋白轉至NC膜上，含3%牛血清白蛋白的TBS溶液封閉30 min，一抗4℃封閉過夜，T-TBS漂洗后，HRP結合的二抗以1∶1 000孵育1 h，DAB 顯色，照相留底。

1.5 CAT活力測定 稱取海馬組織重量，置于9倍生理鹽水中，電動勻漿器研磨成10%組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清10 μl，加入9倍的生理鹽水，變為1%的海馬勻漿液100 μl，按試劑盒說明書進行操作。最后405 nm處測OD值。

1.6 GSH-PX活力測定 稱取海馬組織重量，置于9倍生理鹽水中，電動勻漿器研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清 10 μl，加入 390 μl生理鹽水，變成 0.25% 的海馬勻漿液400 μl，按照試劑盒說明書進行操作。最后412 nm處測OD值。

2 結果

2.1 Sal B顯著改善AD大鼠的學習記憶能力 隨著時間推移，各組大鼠尋找平臺的潛伏期逐漸縮短，學習能增強記憶能力。但是模型組和空白組相比，其潛伏期明顯延長(P＜0.01);治療組和模型組相比，治療組的潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。見表1、表2。

2.2 各組大鼠CAT、GSH-PX比較 由表3能夠看出模型組大鼠海馬中CAT活性顯著下降(P＜0.05)。經Sal B治療后，模型組大鼠海馬的CAT活性明顯提高(P＜0.05)。模型組大鼠海馬中GSH-PX活性顯著下降(P＜0.05)。經Sal B治療后，模型組大鼠海馬的GSH-PX活性明顯提高(P＜0.05)。

2.3 各組凋亡相關蛋白 模型組bcl-2明顯下降(P＜0.01)，caspase-3激活(P＜0.01);給予Sal B處理后，bcl-2表達量上升，caspase-3激活被抑制(P＜0.01)。見圖1。

表1 各組大鼠學習期間每日平均潛伏期(±s ，s，n=12)

表1 各組大鼠學習期間每日平均潛伏期(±s ，s，n=12)

1)與空白組比較，2)與模型組比較:P＜0.01;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天空白組 60.0±0 40.2±3.4 28.2±3.5 16.0±4.2 9.1±2.8 8.7±3.1模型組 60.0±0 54.6±5.61) 48.3±4.31) 37.5±4.21) 32.3±4.31) 26.2±4.31)治療組 60.0±0 45.0±3.22) 33.3±4.02) 20.0±4.32) 12.4±4.22) 12.2±3.22)

表2 各組大鼠空間記憶實驗結果(±s ，n=12)

表2 各組大鼠空間記憶實驗結果(±s ，n=12)

組別 第Ⅲ象限停留時間(s) 穿越平臺次數(次)空白組45.3±2.2 6.2±1.21模型組 21.1±4.31) 3.3±2.11)治療組 40.1±3.12) 5.3±2.22)

表3 各組大鼠海馬組織CAT活力比較(±s，n=10)

表3 各組大鼠海馬組織CAT活力比較(±s，n=10)

組別 CAT(U/mgprot) GSH-PX(U/mgprot)空白組18.3±1.2 162.2±14.5模型組 12.1±1.41) 136.4±13.41)治療組 17.5±1.32) 155.6±13.32)

圖1 凋亡相關分子的表達變化

3 討論

AD的主要病理變化是β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過度磷酸化和突觸丟失，它的發病機制有多種學說，但都無法做出全面解釋。東莨菪堿是一種M受體的拮抗劑，腹腔注射可導致大鼠的空間學習記憶能力出現障礙，被廣泛應用來模仿AD病人的記憶損傷〔3〕。

Sal B是從丹參中分離出來的主要水溶性酚酸類的化合物，是丹參中重要的活性部位之一，它在水溶性酚酸類化合物的活性成分中含量高于50%〔4〕。以往研究顯示Sal B具有抗氧化、對抗β淀粉樣蛋白誘導的細胞毒性、促進血管內皮增殖等功能〔5〕。鐘靜等〔6〕報道Sal B能夠促進腦缺血后海馬齒狀回顆粒下層和側腦室下層神經干細胞增殖和分化，在腦缺血損傷中發揮重要的保護作用。張敏等〔7，8〕報道Sal B可以上調血管內皮生長因子的mRNA水平和蛋白水平，能夠保護血管性癡呆動物模型的學習記憶能力。

本實驗表明Sal B可以改善AD模型大鼠的空間學習記憶能力(P＜0.01)，其機制可能是通過改善AD模型大鼠的抗氧化應激和抗凋亡能力來實現的。本實驗為進一步研究AD的治療提供了理論和實驗依據。

1 Ballard C，Gauthier S，Corbett A，et al.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011;377(9770):1019-31.

2 岳喜典，曲桂武，李桂生，等.丹參酚酸B在水溶液中的穩定性研究〔J〕.中草藥，2005;36(2):205-7.

3 徐建民俞海燕.不同劑量的東莨菪堿對大鼠學習記憶能力的影響〔J〕.蘇州大學學報:醫學版，2006;26(1):53-4.

4 Tang MK，Zhang JT.Salvianolic acid B inhibits fibril formation and neurotoxicity of amyloid beta-protein in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2001;22(4):380-4.

5 Zhang RL，Zhang ZG，Zhang L，et al.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia〔J〕.Neuroscience，2001;105(1):33-41.

6 鐘 靜，唐民科，張 妍，等.丹酚酸B對腦缺血再灌注大鼠神經細胞損傷和神經發生的影響〔J〕.藥學學報，2007;42(7):716-21.

7 張 敏，李永江，陳 粲.丹銀提取物對VD模型大鼠學習記憶和海馬VEGF表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(7):2700-1.

8 薛 亮，范英昌，李慶雯，等.丹酚酸B對離體培養內皮祖細胞VEGF、bFGF mRNA表達及抗氧化酶活性的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1):236-8.