異檸檬酸脫氫酶1基因多態(tài)性對(duì)非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響

王 艷 Amit K Mitra Jatinder K Lamba 姬懷雪

1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇徐州 221006；2.美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)藥學(xué)院，美國(guó)明尼蘇達(dá) 55108

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一組高度異質(zhì)性的惡性血液腫瘤。阿糖胞苷是治療AML最重要的一線化療藥物，能提高患者生存率[1-2]。然而，阿糖胞苷耐藥的產(chǎn)生一直是影響AML患者生存率的瓶頸[2]。因此，鑒定影響阿糖胞苷耐藥性的關(guān)鍵基因的變異，對(duì)于避免阿糖胞苷耐藥性的發(fā)生有重要作用。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）是近期發(fā)現(xiàn)的一種NADP依賴型的異檸檬酸脫氫酶[3]。研究發(fā)現(xiàn)，IDH1基因突變致與急性白血病的發(fā)生與不良預(yù)后密切相關(guān)[4]。然而，IDH1對(duì)非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響目前并不清楚。本研究旨在探討IDH1對(duì)非洲人群AML患者阿糖胞苷耐藥性的影響，為提高該人群AML患者阿糖胞苷的療效，降低不良反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

應(yīng)用來(lái)自國(guó)際人類(lèi)基因組計(jì)劃60個(gè)非洲人（YRI）EBV病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞系（lymphoblastoid cell line，LCL）。上述細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Coriell醫(yī)學(xué)研究所。將上述細(xì)胞株置于含有L-谷氨酰胺（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD）的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加15%熱滅活血清37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)[5]。

1.2 阿糖胞苷的細(xì)胞耐藥性檢測(cè)

阿糖胞苷耐藥性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。予不同濃度的阿糖胞苷（1，5，40，80 μmol/L）加入細(xì)胞中共培養(yǎng)72 h后，應(yīng)用alamar Blue試劑盒（Biosource international，Camarillo，CA）參照制造商說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞存活曲線、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。梯形法計(jì)算阿糖胞苷曲線下面積（AUC）判斷該藥的耐藥性（以更高的AUC表示），AUC進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換后統(tǒng)計(jì)分析[6]。

1.3 IDH1基因多態(tài)性檢測(cè)

DNA樣本來(lái)自HapMap非洲人群的LCL細(xì)胞株。參照文獻(xiàn)[7]，針對(duì)IDH1突變熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，由明尼蘇達(dá)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心合成。引物序列如下：

正向：5'CTCAGAGCCTTCGCTTTCTG3'；

反向：5'TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT3'。 Taqman PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7 min；然后95℃變性30 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 40 s，35 個(gè)循環(huán)后，70℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)目的條帶樣本由明尼蘇達(dá)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中序列比對(duì)（BLAST）比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件R軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)。連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）與單倍型分析、單倍型人群頻率估算采用Haploview 4.2分析。IDH1 SNPs的基因型、最小等位等位基因與阿糖胞苷AUC的分析采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)及Wilcox檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，非洲人群樣本中，IDH1 rs10173938、rs10192397與阿糖胞苷更高的AUC相關(guān)（提示耐藥）。其中，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [rs10173938：AA 比（AC+CC），P=0.040]。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（rs10192397：（CC+CT）比 TT，P=0.036]。 見(jiàn)表 1。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，IDH1 的 SNPs（rs10173938、rs10192397）變異與非洲人群AML患者的阿糖胞苷耐藥性有關(guān)。IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者對(duì)阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10173938的最小等位基因A可能是該部分人群對(duì)阿糖胞苷耐藥的風(fēng)險(xiǎn)因子。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10192397的最小等位基因T可能是該部分人群對(duì)阿糖胞苷耐藥的風(fēng)險(xiǎn)因子。具體的功能及意義在進(jìn)一步研究中。

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對(duì)阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對(duì)阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

注：P1為 AA 比（AC+CC）；P2為（CC+CT）比 TT

rs10173938 rs10192397內(nèi)顯子內(nèi)顯子AA（n=16）AC（n=32）CC（n=9）CC（n=13）CT（n=34）TT（n=13）3295.371±658.214 2833.301±497.002 3195.382±776.748 2857.324±540.578 2780.298±630.892 3285.368±585.815 P1=0.040 P2=0.036 rs編號(hào) 定位 基因型 阿糖胞苷曲線下面積 P值

IDH1基因突變是急性白血病的發(fā)生及不良預(yù)后的重要因素。IDH1密碼子132R的突變能誘發(fā)細(xì)胞因子自主性，阻礙造血干細(xì)胞分化，誘導(dǎo)AML發(fā)生[7-8]。近期文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶有IDH1密碼子132R和IDH2密碼子R172突變基因的正常核型急性髓細(xì)胞白血?。–N-AML）患者或同時(shí)伴有IDH及NPM1變異的老年CN-AML患者應(yīng)用阿糖胞苷化療后易發(fā)生阿糖胞苷耐藥，完全緩解率降低[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，IDH1的SNPs（rs10173938、rs10192397）與非洲人群樣本中阿糖胞苷的耐藥性有關(guān)。進(jìn)一步證明，IDH1基因突變是導(dǎo)致AML患者不同的預(yù)后及阿糖胞苷耐藥發(fā)生的重要因素。具體功能及機(jī)制需要大樣本研究進(jìn)行證實(shí)。

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