高效液相色譜法測定醬油和食醋中4種對羥基苯甲酸酯

肖麗恒，呂任一，何學梅，謝啟明

(1.楚雄州質量技術監督綜合檢測中心，云南 楚雄 675000;2.楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000)

對羥基苯甲酸酯類是一種廣譜抑菌食品防腐劑，在食品生產、加工、儲存等過程中廣泛用于抑制微生物的繁殖，以防止食品腐敗變質，延長食品保質期［1—2］。但過量使用，會嚴重危害人的身體健康。我國對對羥基苯甲酸酯類防腐劑的使用量和殘留量上都有著十分嚴格的規定和要求，醬油、食醋中的最大使用量不超過0.25g/kg［3］。因此，為了確保人類身體健康和安全，建立快速、高效、高選擇性和高靈敏度的測定食品中對羥基苯甲酸酯類防腐劑的方法具有重要意義。

當前，對羥基苯甲酸酯類防腐劑的測定方法主要有高效液相色譜法［4—9］、薄層色譜法［10—11］、毛細管電泳法［12］、氣相色譜法［13—17］、高效液相色譜串聯質譜檢測法［18—19］等。其中，應用比較廣泛的是高效液相色譜法和氣相色譜法，而薄層色譜法和毛細管電泳法應用的相對較少，高效液相色譜串聯質譜檢測法檢測投入較多，應用也不多。此外，對羥基苯甲酸酯類防腐劑有好多種，而且都在生活中廣泛使用［16—17］，這就需要開發出能同時檢測多種不同樣品中多種添加劑的測定方法［12—15］。因此，本文擬建立一種能夠快速、簡單、高效和準確地同時測定醬油和食醋中4種對羥基苯甲酸酯的高效液相色譜法方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜系統LC－20A(日本島津公司)，配套二極管陣列檢測器SPD－M20A及色譜管理軟件LCsolution;輸液泵LC－20AB;自動進樣器SIL－20AC;色譜柱柱溫箱CTO－20AC;去離子水純化系統EasyDI8(美國Millipore公司);漩渦混合器QL－861;超聲波清洗器AS20500AT;分析天平 (LA204、CPA225D);離心機 (凱達TG16G)。

乙腈為色譜純，乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉等試劑均為分析純。實驗用水均為超純水。

對羥基苯甲酸酯標準品 (美國Sigma公司):對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯，純度≥99%。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil－C18，粒度5μm，4.6mm×250mm(ID×L);檢測波長:254nm;流速:1.0mL/min;進樣量:10μL;流動相A為乙腈，流動相B為乙酸銨緩沖液 (20mmol/L，并調節PH為4);柱溫:40℃。梯度洗脫程序如下表1:

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3 實驗方法

1.3.1 標準貯備液和工作溶液的配制

分別準確稱取25.0mg對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯標準品于4個25 mL容量瓶中，先用少量乙腈溶解后，再用乙腈定容至刻度。配制成1.00 mg/mL的單標儲備液，冷藏保存。

用移液管準確量取1mL各標準貯備液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，配制成100mg/L的中間液。

根據檢測的實際要求，取中間液根據不同的濃度，用流動相稀釋到相應濃度的混合標準工作溶液，濃度系列:0.0 mg/L、7.5 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L、37.5 mg/L、50.0mg/L。

1.3.2 樣品準備和處理

搖勻并稱取醬油或食醋樣品5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL比色管中，加入1mon/L的氫氧化鈉溶液1 mL，加入適量的去離子水，漩渦混合1min，水浴超聲波輔助提取10 min，取出，加入2mL乙酸鋅和2mL亞鐵氰化鉀溶液混勻，調節pH至中性，用去離子水定容到50ml，慢速濾紙過濾，濾液經0.45 μm微孔濾膜過濾后作為試液供高效液相色譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的確定

醬油食醋營養成分十分豐富，含有大量的醬色、蛋白質及鹽類。如果直接過0.45um的濾膜進行進樣，會造成液相色譜柱的堵塞。因此，色譜分離前，須對樣品進行凈化處理，以除去多余的雜質，保護色譜柱，延長使用壽命。如用甲醇或者乙醇提取，樣品中所含雜質較多，且甲醇有一定的毒性。而乙酸鋅－亞鐵氰化鉀是蛋白質以及其它大分子極性物質的經典的沉淀試劑［9］，而且廣泛運用于食品分析中，且使用方便。所以，本實驗采用乙酸鋅－亞鐵氰化鉀作沉淀劑，同時加1mL1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，處理效果十分滿意。

2.2 流動相的選擇

為了選擇合適的檢測條件，分別對甲醇－水、甲醇－乙酸銨緩沖液、乙腈－水和乙腈－乙酸銨緩沖液四種流動相體系進行了試驗。結果顯示，使用乙腈－水流動相、甲醇－水流動相體系，在相同的試劑配比下，分析時間明顯太長。而選擇甲醇－乙酸銨緩沖液流動相體系，分析時間也較長。在同等條件下選擇乙腈－乙酸銨緩沖液作為流動相，它能較好地分離四種對羥基苯甲酸酯類，而且能有效地縮短總分析時間。實驗表明，當乙腈體積分數為30%時為初始的流動相最為適合，分離效果好，而且保留時間合適。

2.3 檢測波長的選擇

對羥基苯甲酸酯的吸收光譜波長分別為在226nm，248nm，257nm，255nm，256nm，253nm處表現高靈敏度［4—9］，但是，我們在進行檢測時發現，在波長254nm靈敏度相對更好，因此選擇254nm作為實驗的最佳檢測波長。

2.4 方法的評價

2.4.1 標準曲線的線性范圍和最低檢測限確定

對羥基苯甲酸酯類標準品混合溶液通過高效液相色譜采用1.2的檢測條件進行檢測分析，色譜圖如圖1所示。

圖1 四種對羥基苯甲酸酯類標準品的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of 4 p－hydroxybenzoates standards

實驗結果表明，在乙腈－乙酸銨緩沖液為流動相條件下，各組分保留時間和分離效果都較好。用各組分的峰面積與質量濃度的相關關系進行線性回歸分析，其中Y代表峰面積，X代表進樣質量濃度，得出相應回歸方程和相關系數。并且，對羥基苯甲酸酯在0.0～50.0 mg/L時，有著良好的線性關系。在此實驗條件下，對羥基苯甲酸酯類以5倍基線噪聲所對應的濃度作為方法的最低檢測限。根據信噪比 (S/N=5)計算，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯的檢測限分別為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.2 mg/kg。本方法的線性回歸方程和檢出限如表2所示。

表2 對羥基苯甲酸酯的線性回歸方程和檢出限Table 2 Linear regression equation and detection limits of p－hydroxybenzoates

2.4.2 準確度和精密度

選取醬油、食醋樣品，分別按表3添加水平進行加標回收實驗，同時做樣品空白實驗，空白結果如圖3所示。

樣品經過處理后，通過高效液相色譜儀進行測定。樣品中對羥基苯甲酸酯類加標回收的HPLC檢測，結果如圖4所示。

圖3 醬油樣品色譜圖Fig. 3 Chromatograms of a soy sauce

圖4 醬油中添加4種對羥基苯甲酸酯色譜圖Fig.4 Chromatograms of soy sauce added with 4 p－hydroxybenzoates standards

對樣品在同一天內每一濃度進行平行測定6次，采用外標法對樣品加標進行校正，取平均值計算回收率和精密度，結果見表3。實驗表明，本方法加標回收率比較穩定 (86.3% ～101.6%)，不同樣品在不同加標水平上的回收率比較穩定。不同濃度的對羥基苯甲酸酯在醬油、食醋樣品中的相對標準偏差分別為0.9%～3.1%和0.7%～2.9%，結果見表4。精密度滿足醬油和食醋中對羥基苯甲酸酯類含量的分析要求。

表3 醬油和食醋中對羥基苯甲酸酯的加標回收率和精密度結果 (n=6)Table 3 Recoveries and precisions of p－hydroxybenzoates in soy sauce and vinegar(n=6)

p－Hydroxybenzoates Added/(mg/kg)Average recovery/%soy sauce vinegar RSD/(%)soy sauce vinegar 593.3 92.3 3.1 2.3 IPP 10 94.5 97.7 1.8 1.215 99.1 99.5 1.9 1.6586.3 90.3 2.7 2.9 PP 10 97.6 101.6 1.7 2.415 99.5 99.3 0.9 1.1

3 結論

本文建立了高效液相色譜法測定醬油、食醋中四種對羥基苯甲酸酯類物質含量的方法。樣品經過處理后，對羥基苯甲酸酯在0.0～50.0mg/L時，有著良好的線性關系，r=0.9999，四種對羥基苯甲酸酯的檢出限可達到0.1～0.25mg/kg(S/N=3)。該方法效果穩定，操作簡單，結果準確，為醬油、食醋中對羥基苯甲酸酯類物質的檢測提供了一種新的快速、有效的檢測方法。

［1］李永飛，沈良，齊艷，等.尼泊金復合酯在醬菜生產中的應用 ［J］.中國釀造，2004，（4）：19—20.

［2］牟冠文，李光浩.食品防腐劑的概況及其檢測方法 ［J］.食品與發酵工業，2006，32（10）：103.

［3］GB 2760－2011，食品添加劑使用衛生標準 ［S］.

［4］查玉安，趙亞華.高效液相色譜法測定化妝品中7種防腐劑 ［J］.職業與健康，2002，18 （4）：34.

［5］靳克林.高效液相色譜法測定化妝品中防腐劑 ［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15（3）：317—318.

［6］聶西度，謝華林，彭書萍.高效液相色譜法測定化妝品中防腐劑的研究 ［J］.分析科學學報，2005，21 （2）：231—232.

［7］周建科，王立雙，趙瑞峰.液相色譜法測定醋中對羥基苯甲酸酯類防腐劑 ［J］.中國調味品，2008，6 （6）：47—48.

［8］楊華梅.高效液相色譜法測定醬油中4種尼泊金酯含量 ［J］.中國釀造，2009，（10）：146—147.

［9］陳俊，周路明.亞鐵氰化鉀－乙酸鋅在HPLC測定醬油中防腐劑的應用 ［J］.中國調味品，2007，（10）：72—73.

［10］王萍.薄層層析法測定化妝品中多種防腐劑 ［J］.環境與健康雜志，1997，14（4）：171.

［11］林秀蓉，古國隆，鐘玉明.食品中對羥苯甲酸酯類防腐劑之簡易快速氣相層析定量分析 ［J］.臺灣農業化學與食品科學，2000，38（1）：59—70.

［12］方明，李勇.飲料、醬菜中苯甲酸含量的高效毛細管電泳檢測方法 ［J］.中國食品添加劑，2006，（2）：156—158.

［13］白艷玲，張彩虹，陳劍剛.化妝品8種防腐劑同時測定的氣相色譜法 ［J］.環境與健康雜志，2004，21 （3）：170—171.

［14］劉剛，趙剛，王小芳.氣相色譜法分析化妝品中防腐劑 ［J］.色譜，2002，20（3），274—276.

［15］鮑忠定.毛細管氣相色譜內標法同時測定食品中8種防腐劑 ［J］.分析化學，2004，32 （2）：270—271.

［16］殷德榮.毛細管氣相色譜法同時測定食品中多種防腐劑 ［J］.實用預防醫學，2005，12 （1）：168.

［17］迪麗努爾·馬力克，龐楠楠，劉虎威.快速氣相色譜法測定食品中的六種常見防腐劑 ［J］.新疆師范大學學報 （自然科學版），2005，24（1）：51—53.

［18］吳剛，趙珊紅，吳儉儉.凝膠滲透色譜凈化—超高效液相色譜—串聯質譜法測定皮革制品中7種尼泊金酯類防腐劑 ［J］.色譜，2011，29（6）：501.

［19］凌云，儲曉剛，張峰.超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定調味料中的17種防腐劑和抗氧化劑 ［J］.色譜2011，29 （8）：723—730.