全顱放療對大鼠血腦屏障LRP和P-gp表達的影響及臨床意義

齊彩霞

（山西大同大學醫學院，山西 大同 037009）

全顱放療對大鼠血腦屏障LRP和P-gp表達的影響及臨床意義

齊彩霞

（山西大同大學醫學院，山西 大同 037009）

目的探討不同劑量放射線對大鼠血腦屏障上肺耐藥相關蛋白（LRP）、多藥耐藥蛋白（P-gp）表達的影響影響及其其臨床意義。方法將50只成熟雄性Wister大鼠隨機分為5組，分別采用0，10，20，30，40 Gy60Coγ射線進行全腦常規分割外照射,1次/d,2 Gy/次,5次/周。于完成預定照射劑量后16 h斷頭取腦,采用免疫組化法檢測各組大鼠血腦屏障上LRP和P-gp的表達情況。結果0 Gy組LRP和P-gp表達均較強,隨著照射劑量的增加,LRP表達呈現逐漸下降趨勢,其中20 Gy下降最明顯,30,40 Gy組下降幅度減弱,40 Gy時表達最弱。20,30,40 Gy組和對照組比較差異有顯著性；10 Gy組與20,20,30,40 Gy組比較差異有顯著性；其余各組比較無統計學差異。P-gp的表達也隨著照射劑量的增加呈現減弱的趨勢,20 Gy降低幅度最大,30 Gy時達到最低值,40 Gy時略增強。對照組分別與20,30,40 Gy組相比較,差異有顯著性；10 Gy組與20,30,40 Gy組比較,差異有顯著性；其余各組比較無差異。結論一定劑量的放射線作用于大鼠血腦屏障之后,其上的耐藥相關蛋白表達均可降低,20Gy時降低最明顯,此時配合化療藥物效果最佳。

血腦屏障；放射療法；顱腦照射；肺耐藥相關蛋白；P－糖蛋白

顱內腫瘤對絕大多數化療藥物不敏感,放射治療仍然是其主要治療手段。但單純的放射治療對于顱內腫瘤來說來說療效較差,中位生存期不長。因此關于顱內腫瘤的綜合治療成為研究熱點。許多研究發現,顱內腫瘤化療效果不佳與血腦屏障的存在有很大關系。近年來隨著分子生物學研究水平的提高,發現血腦屏障上也存在著多種耐藥相關蛋白,產生多藥耐藥現象[1]。其主要的多藥耐藥相關蛋白有肺耐藥相關蛋白（LRP）、P-糖蛋白（P-gp）,與血腦屏障的作用極為密切[2-3]。LRP在血腦脊液屏障中有過度表達,在正常的腦組織和腫瘤血管中均表達明顯[4],與細胞內的物質轉運有關,可以獨立于P-gp發揮作用。P-gp在腦血管內皮細胞內可以檢測到強陽性表達[5],發揮物質轉運載體作用,能夠把已進入細胞內的各類有害物質包括藥物轉運到細胞外,降低藥物在細胞內的有效濃度,在保護腦組織的同時也削弱了抗腫瘤藥物的效果。本研究通過對大鼠進行不同劑量的射線照射,觀察其對血腦屏障上LRP和P-gp表達的影響,從而在病理學基礎上獲得放射線可以提高血腦屏障藥物通透性的理論依據,進一步指導臨床在進行放療的同時選擇合適的時機進行化療,以提高顱內腫瘤的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

正常成熟雄性Wister大鼠（青島藥物研究所）,體質量190～310 g,平均257 g。

1.1.2 實驗試劑

鼠抗人LRP單克隆抗體,兔抗鼠P-gp單克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司）；EDTA抗原修復液,通用型兩步法試劑盒,DAB顯色劑,非免疫動物封閉兔血清均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

將50只大鼠隨機分為5組,即對照組,10,20, 30,40 Gy組,每組10只。

1.2.2 照射方法

大鼠經水合氯醛麻醉后俯臥位固定于特制治療床上,經模擬定位后進行全腦外照射。采用60Coγ射線,源皮距75 cm,照射野約2.5 cm×2.5 cm,上界位于雙眼后眥連線,下界位于雙耳后連線,左右露空,垂直照射,2 Gy/次,1野/次,5次/周。

1.2.3 樣本采集及制備

照射計劃完成后16 h,斷頭取腦,40 g/L中性甲醛固定24 h后,石蠟包埋,制備4μm厚的石蠟切片。

1.2.4 LRP與P-gp檢測

采用免疫組化S-P法。對照組用PBS代替一抗,LRP工作液濃度1∶80,P-gp工作液濃度1∶200

1.2.5 陽性結果判斷標準

在40倍顯微鏡下觀察,P-gp表達陽性的細胞,在細胞膜和細胞漿中會出現棕黃色顆粒；LRP呈細胞漿表達,胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性。在高倍顯微鏡下選取5個視野,每個視野計數100個細胞,累計陽性細胞數。同時檢測累計吸光度值（IOD）,判斷在射線作用下腦細胞上LRP和P-gp的表達變化情況。

1.3 統計學分析

采用IPP6.0分析系統進行圖像分析。SPSS11.5統計軟件進行數據處理,數據間比較采用方差分析,兩樣本均數之間的比較采用q檢驗,P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 血腦屏障上LRP的表達

對照組LRP表達最強,隨著射線劑量逐漸增加, LRP表達呈現減弱趨勢,20Gy時減弱最明顯,40Gy時表達最弱。20,30,40 Gy組和對照組比較差異有顯著性；10 Gy組與20,30,40 Gy組比較差異有顯著性；其余各組比較差異無統計學意義,見表1。

2.2 血腦屏障上P-gp陽性細胞數目的表達

對照組P-gp表達陽性的細胞數目最多,隨著照射劑量增加,陽性細胞數目逐漸減少,30 Gy時最少,當劑量達到40 Gy時陽性細胞數目略增多。20,30,40 Gy組和對照組比較,差異有顯著性；10 Gy組與20,30,40 Gy組比較,差異有顯著性；其余各組比較差異無統計學意義,見表1。

2.3 LRP與P-gp的累計吸光度值（IOD）測定結果

各組LRP與P-gp的累計吸光度值（IOD）測定結果與陽性細胞數檢測結果相似。LRP檢測：隨著照射劑量的增加,呈現減弱的趨勢,其中20 Gy組減弱最明顯,30,40 Gy組減弱幅度縮小。20,30,40 Gy組和對照組比較,差異有顯著性；10 Gy組與20, 30,40 Gy組比較,差異有顯著性；其余各組間比較無統計學意義。P-gp檢測：20,30,40 Gy組和對照組比較,差異有顯著性；10 Gy組與20,30,40 Gy組比較,差異有顯著性；其余各組間比較無統計學意義。見表2。

3 討論

惡性腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢,其中腦內的原發腫瘤及腦轉移瘤的發病率也隨之提高。由于腦組織內存在有特殊的生理結構--血腦屏障,使得顱內腫瘤的治療效果欠佳,患者的中位生存期較短。尋求合適的治療時機,制定最佳的綜合治療方案,已成為腫瘤科醫生研究的一個重要課題。國內外學者通過大量實驗研究,證實顱內原發及轉移瘤病灶周圍的血-腦脊液屏障的功能已被完全或部分破壞。影響腦瘤患者治療療效的主要因素與血腦屏障的功能關系不大,其主要原因可能與血腦屏障上存在的大量多藥耐藥相關蛋白有關。這些蛋白質在腦組織內發揮載體作用,可以把已經進入細胞的化療藥物重新轉運出細胞,而減弱化療藥物對惡性腫瘤細胞的殺傷能力,進一步在很大程度上降低了抗腫瘤藥物的作用效果。

本實驗設計就是通過利用各組劑量不等的放射線分別作用于大鼠的腦組織,觀察其對血腦屏障上LRP，P-gp表達的影響及其變化趨勢。結果提示,空白對照組中LRP和P-gp的表達均為強陽性,隨著照射劑量的逐步增加,LRP的表達一直呈下降趨勢,其中在20 Gy組下降幅度最大,30,40 Gy組下降的幅度減小,射線劑量達到40 Gy時表達最弱。P-gp在大鼠接受20 Gy的射線照射之后,表達明顯減弱,30 Gy組表達最弱,但當照射40 Gy時P-gp的表達又略為增強。此結果與Mima所做的動物實驗結果相似[6]。P-gp表達呈現這種變化趨勢提示,一定劑量的放射線可以減弱P-gp在血腦屏障上的表達,但是當射線劑量達到一定水平之后,也會誘導其表達。由此可知,通過放射治療可以降低多藥耐藥相關蛋白在血腦屏障上的表達,從而提高化療藥物在腦組織中的濃度,增強化療效果。而目前對于顱內腫瘤患者來說,全顱放療已成為其常規的治療方法,在患者接受一定劑量放射線之后,加用化療藥物,可以提高其綜合治療療效,延長中位生存期。該實驗顯示,在射線劑量達到20～30 Gy時,加用化療藥物,是采取同期放化療的最佳時機。

表1 各組LRP和P-gp陽性細胞數比較（±s,n=10）

表1 各組LRP和P-gp陽性細胞數比較（±s,n=10）

注：F LRP=18.52,F P-gp=10.99,組間存在差異。與對照組比較,*q=6.87～9.85,P＜0.01；★q=5.84～7.46,P＜0.01；與10 Gy組比較,△q=5.27～8.24,P＜0.05；▲q=4.69～6.30, P＜0.05

組別／組LRP P-gp對照組66.73±12.19 58.87±16.60 10 Gy 60.16±18.37 53.94±15.05 20 Gy 38.56±10.93*△33.89±13.48★▲30 Gy 32.60±8.27*△26.99±12.73★▲40 Gy 29.36±12.80*△32.60±8.27★▲

表2 各組IOD值比較（±s,n=10）

表2 各組IOD值比較（±s,n=10）

注：F LRP=668.42,F P-gp=118.81,各組間存在差異。與對照組比較*q=47.04～49.64,P＜0.01；★q=20.32～22.85, P＜0.01；與10 Gy組比較,△q=44.82～47.43,P＜0.01；▲q=17.54～20.07,P＜0.01

組別／組LRP P-gp對照組109.88±3.19 101.21±4.63 10 Gy 107.69±4.16 97.88±2.32 20 Gy 63.29±2.88*△76.89±5.48★▲30 Gy 62.24±2.47*△73.86±2.57★▲40 Gy 60.71±2.68*△77.06±2.86★▲

由于腦組織的生理特殊性,使得發生于腦組織的惡性腫瘤不能通過手術完全切除,如何提高化療藥物在腦內的作用濃度就成了國內外學者的研究熱點。大量研究結果表明,在人體可承受的范圍之內,接受中等劑量以及低劑量射線的外照射能夠減弱腦組織細胞內的一些多藥耐藥相關基因的表達,使腫瘤細胞對藥物敏感性提高。其發揮作用的機制可能是：射線直接作用于DNA,使DNA的單鏈或雙鏈斷裂,破壞其正常分子結構,其調控作用發生改變,比如說原來的癌基因可以轉變為抑癌基因；同時由于電離產生的作用可以間接地激活某些細胞基因的表達,使細胞原來正常的周期信號轉導發生改變等。近年來,關于怎樣減弱血腦屏障的作用,提高其對藥物的通透性所進行的實驗研究也非常多,其中不乏一些有效的方法,比如說腦室內直接穿刺給藥、應用血管活性藥物、或者是利用具有芳香開竅作用的中藥等等。然而以上這些方法臨床實施起來,或者對患者的創傷較大,患者由于恐懼而不能很好地配合；或者是藥物的副作用太大,患者不能長期耐受：總之不利于臨床長期應用。利用射線照射,在患者進行常規放療的同時,選擇合適時機加用化療藥物,在很大程度上減輕了患者的痛苦,也很有效提高了腦腫瘤患者的綜合治療效果,延長其中位生存期。

[1]賀昭忠,吳承遠.腦膠質瘤多藥耐藥基因表達及其對化療藥物敏感性[J].齊魯醫學雜志,2002,17（2）：98-100.

[2]王冰,潘彥舒,李澎濤.血-腦脊液屏障上的藥物轉運體P-糖蛋白[J].現代生物醫學進展,2007,7（1）：115-119.

[3]Beaulieu E,Demeule M,Ghitescu L.P-glycoprotein is strongly expressed in the luminalmembrances of the endothelium of blood vessels in the brain[J].JBiochem,1997,326：539-544.

[4]Tews D S,Nissen A,Kulgen C,et al.Drugresistance-associated factors in primary and secondary glioblastomas and their precursor tumors[J].JNeurooncol,2000,50（3）：227-237.

[5]Beaulieu E,Demeule M,Ghitescu L.P-glycoprotein is strongly expressed in the luminalmembrances of the endothelium of blood vessels in the brain[J].Biochem J,1997,326：539-544.

[6]Mima T,Toyonaga S,Mori K,et al.Early decrease of P-glycoprotein in the endothelium of the rat brain capillaries aftermoderate close of irradiation[J].Neurol Res,1999,21（2）：121.

〔責任編輯 楊德兵〕

Impact of Expression and Significance of Lung Resistance-related Protein，P-glycoprotein at Blood-brain Barrier after W hole Brain Conventional Fractionation Irradiation in Rats

QICai－xia
（Medical School，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Abtract：Objective To explore the effect of expression of LRP and P－gp at blood－brain barrier after different doses of whole brain conventional fraction irradiation in rats.Methods According to different irradiation doses，50 adult male Wistar rats were divided random ly into 5 groups：the normal control group（0Gy）；10Gy；20Gy；30Gy；40Gy～group.All rats were exposed to conventional fravtionation（2Gy／d，5d／w）withγ－ray.All rats were killed and collected brain 16 hours after whole brain irradiation and detected expression of LRP，P－gp at BBB by SP immunohistochemistry.Result LRP and P－gp was hign expression in normal BBB.With the increase of radiation dose，expression of LRP and P－gp decreased to varying degree.The positive cells of P－gp were lowest in 30Gy group.The positive cells of LRPwere lowest in 40Gy group.All the date was analyzed with rank testof transform.The positive cellswas significantly differentexcept the control and 10Gy，20Gy and 30Gy，20Gy and 40Gy，30Gy and 40Gy.Conclusion A certain dose irradiation can decrease expression of LRP and P－gp.It can be considered as the optimum time of chemotherapy when the whole brain irradiation ranges from 20Gy to 30Gy.

blood－brain barrier；radiation therapy；brain irradiation；lung resistance－related protein；P－glycoprotein

R739.41

A

2013－08－08

齊彩霞（1977－），女，山西大同人，碩士，助教，研究方向：腫瘤學。

1674－0874（2013）05－0061－02