山羊Klf4基因克隆、原核表達和His-Klf4融合蛋白純化

辛桂瑜 王麗霞 葉新慧 申魁魁 符欣蕙 李恭賀 張明，2盧晟盛，2 盧克煥，2 鄭喜邦

Klf4（Krüpple like factor 4，Krüpple 樣 因 子 4）是一類含3個鋅指結構的雙向轉錄因子。長期以來，由于Klf4在細胞增殖、分化、生長特別是與腫瘤的發生、發展有密切關系而備受關注。Klf4可以促進胚胎干細胞的自我更新［1］；Sikora 與 Ghosh［2，3］的研究還表明，Klf4具有促進表皮的增殖分化以及抑制膀胱癌等惡性腫瘤發生等多種功能。Klf4在許多類型的腫瘤中特異性過表達或者缺失，例如，在結腸癌、小腸癌、膀胱癌、前列腺癌和食道癌等腫瘤中Klf4低表達［4-8］，胃癌中Klf4有雜合性缺失的表現［9］，而在原發性乳腺導管癌以及口腔鱗癌中Klf4高表達［10，11］。近年來對干細胞的相關研究表明，Klf4等因子參與體細胞重編程，并發揮重要作用［12］。Takahashi 等［13］將 Klf4、 Sox2、Oct4、c-Myc 四 個轉錄因子導入小鼠成纖維細胞中，獲得了iPS細胞（induced pluripotent stem cells），這一突破為患者自身遺傳特性的ES細胞獲取提供了新的途徑，也為臨床治療提供了新的研究方向。此后，Takahashi 等［14］用同樣的方法獲得了人類iPS 細胞 。 Hanna 等［15］利用人類鐮狀細胞性貧血的小鼠動物模型，對其導入Klf4、Sox2、Oct4及c-Myc基因，將小鼠皮膚成纖維細胞重編程為自體iPS細胞，并對iPS細胞進行誘導分化，從而得到造血功能正常的前體細胞，進而起到了治療作用。迄今為止，已相繼獲得了獼猴、豬、大鼠和綿羊等物種的iPS細胞［16-19］，但是尚未見有關山羊體細胞重編程的報道。王春生等［20］、楊越飛等［21］對小鼠和綿羊Klf4基因分別進行了原核及真核表達的研究，但山羊Klf4基因的研究未見報道。

本研究旨在克隆山羊Klf4基因，并構建其原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達，純化His-Klf4融合蛋白，從而為其多克隆抗體制備奠定基礎，也為進一步研究山羊多能干細胞創造良好條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α，質粒pET-30a由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol LS?Regent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；反轉錄試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶EcoR I和Hind Ⅲ、pMD18-T載體、IPTG，膠回收試劑盒均購自寶生物工程有限公司（大連）；蛋白預染Marker購自Fermentas公司（立陶宛）；DNA Marker 2000購自百維信生物科技有限公司（廈門）；EB替代染料（GeneFinder核酸染料），購自康為公司（北京）；質粒小量提取試劑盒，購自Omega Bio-Tek公司（美國）；鼠源His標簽抗體、山羊抗鼠IgG購自TIANGEN公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的克隆與測序 根據GenBank中牛Klf4mRNA序列（NM.001105385.1）設計一對引物，在引物5'端分別引入EcoR I和Hind Ⅲ酶切位點。引物由Invitrogen公司合成，預計擴增片段為1 434bp。從山羊生殖脊提取總RNA，再反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。25μL PCR 反應體系為 ：2×GC Buffer I 12.5μL，dNTPmix 2.5μL，上下游引物各0.5μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.15μL， 模 板 cDNA0.75μL， 加 雙 蒸 水 7.25μL。反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，61.6℃退火 90s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳、切膠后，用膠回收試劑盒純化。目的片段與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉化DH5α感受態細菌，涂板。挑斑、增菌、小提質粒，分別用EcoR I和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定，陽性質粒送寶生物工程有限公司測序。

1.2.2 信號肽預測 用DNAStar軟件比較山羊與綿羊、牛、中國水牛、野豬Klf4核苷酸序列同源性；借助SignalP4.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測Klf4編碼蛋白是否存在信號肽。

1.2.3 山羊Klf4原核表達載體構建和鑒定 選擇測序正確的pMD18-T-Klf4陽性質粒，用EcoRI和HindⅢ分別將pMD18-T-Klf4與表達載體pET-30a進行雙酶切，膠回收Klf4目的片段和線性化的pET-30a載體，用T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化DH5α感受態細菌，挑斑、增菌、小提質粒和雙酶切鑒定。陽性質粒送寶生物工程有限公司測序。

1.2.4 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達 經鑒定與測序，將閱讀框正確的重組質粒pET30a-Klf4轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，涂板、挑斑并加入含氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）的LB培養基中，37℃搖床振蕩培養過夜，取重組菌按1∶100體積比轉接入含氨芐青霉素的5mL LB 培養基中，220r/min，37℃ 振蕩培養至 OD600nm=0.4-0.6時，加入終濃度為1mol/L 的 IPTG，37℃誘導表達4h。收集2mL菌液以12000r/min離心4min，沉淀用80μL PBS（pH7.4）懸浮，加入 5×SDS-Loading Buffer 20μL，混勻后置冰上10min，煮沸10min，12000r/min離心5min，取10μL上清進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色確定目的蛋白是否表達。

1.2.5 融合蛋白Western blotting檢測 取上述蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。以濕轉法將目的蛋白轉到NC（硝酸纖維素）膜上，用TBST配制的5％脫脂奶粉室溫封閉2-3h。加入鼠源His標簽抗體（1∶2000）4℃孵育過夜后用TBST漂洗3次，每次10min。加入山羊抗鼠IgG（1∶2000），室溫孵育1-1.5h，用TBST 漂洗3次，每次10min。洗膜后用化學發光劑A、B各250μL滴至保鮮膜上混勻，將NC膜的蛋白面朝下，覆蓋在顯色劑上作用5min，吸取多余的顯色劑，NC膜蛋白面朝上，包裹后固定在暗盒內，壓X光膠片，曝光。經顯影、定影，用預染蛋白Marker判定目的蛋白的相對分子質量。

1.2.6 融合蛋白的純化 將誘導表達成功的重組菌液按1∶100比例轉接5mL LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜。活化的菌液按1∶200比例轉接500mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃培養至OD600nm值達到0.4-0.6時，加入IPTG，37℃繼續誘導4h。以5000r/min 4℃離心8min，收集菌體沉淀并稱重。隨后的蛋白純化按照 Ni-NTA argrose使用說明進行。每1g濕重沉淀加5mL的Buffer B 制成懸浮液；置于室溫下180r/min搖床振搖1h后超聲波破碎10min，以12000r/min 4℃離心20min，取其上清，用0.45μm濾器過濾后緩慢加入含Ni-NTA argrose的純化柱中，室溫下慢速搖動混勻2h，靜置后過柱；用2倍柱床體積Buffer C洗滌3次，用2倍柱床體積 Buffer E洗脫His-Klf4融合蛋白。分別收集少量裂解液上清、沉淀、過柱液、Buffer C和Buffer E洗脫液進行SDS-PAGE分析。純化的蛋白冷凍干燥保存于-80℃冰箱待用。

2 結果

2.1 PCR電泳檢測

提取的山羊生殖脊總RNA經反轉錄，以cDNA為模板，PCR擴增后，產物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在紫外燈下觀察，可發現在約1500bp處有一特異性條帶（圖1），與預期結果相符。

圖1 山羊Klf4 RT-PCR產物凝膠圖

2.2 重組質粒pMD18-T-Klf4的酶切鑒定與測序

將重組質粒pMD18-T-Klf4用EcoR I和Hind Ⅲ進行雙酶切以及1％瓊脂糖凝膠電泳，得到約1500bp目的條帶（圖2），與預期結果相符。測序結果表明Klf4基因的閱讀框由1 434 個核苷酸組成，共編碼478個氨基酸（圖3）。用DNAStar軟件將該基因核苷酸序列分別與綿羊、牛、中國水牛、野豬Klf4進行核苷酸序列同源性比較，結果（表1）分別為98.5％、98.2％、98.0％和 94.2％。 經 過 SignalP 4.0在線分析，山羊Klf4編碼蛋白不存在信號肽（圖4），全長序列可用于原核表達。

圖2 山羊pMD18-T-Klf4雙酶切鑒定

圖3 山羊Klf4基因的測序結果

表1 山羊Klf4基因核苷酸序列與其他物種的Klf4序列同源性比較（％）

圖4 山羊Klf4基因信號肽分析

2.3 重組質粒pET30a- Klf4的酶切鑒定

將原核表達質粒pET30a-Klf4進行EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切以及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到目的片段約為1500bp（圖5），與預期結果相符。結果表明pET30a-Klf4重組質粒構建成功。

圖5 重組質粒pET30a-Klf4酶切鑒定

2.4 pET30a-Klf4在大腸桿菌中的誘導表達與His-Klf4融合蛋純化

SDS-PAG電泳表明，重組質粒pET30a-Klf4在大腸桿菌BL21中得到表達，表達的His-Klf4融合蛋白分子量約為52kD（圖6），與理論值相符。免疫印跡檢測結果（圖7）也與SDS-PAGE電泳結果相一致，在分子量約52kD 處有特異性條帶，說明目的蛋白確實為His-Klf4融合蛋白，融合基因閱讀框正確。在變性條件下，用鎳離子金屬螯合親和層析法純化His-Klf4融合蛋白，經SDS-PAGE分析（圖8），純化產物呈單一條帶，與上述預期結果一致，證明獲得了His-Klf4融合蛋白。

圖6 pET30a-Klf4表達產物SDS-PAGE分析

圖8 His-Klf4純化產物SDS-PAGE分析

3 討論

獲得純化的Klf4轉錄因子蛋白，必須要建立最佳的原核表達體系，而表達載體的選擇又是關鍵的因素之一。在本研究中，我們之前選用pRSET-A作為表達載體，但最終獲得的重組蛋白表達量不高，改用pET-30a后，獲得了表達效率較高的重組蛋白。這是因為pET-30a具有功能強大的T7啟動子，而T7 RNA聚合酶具有較高的選擇性與活性，大多數的細胞資源在誘導充分時都可被用于目的基因的表達，因此可以獲得高效表達的重組蛋白［22，23］。另外，pET-30a載體含有的6×His Tag可作為純化的標志，His融合蛋白經過Ni-NTA argrose層析柱可以進一步純化。

圖7 融合蛋白His-Klf4的Western blotting檢測

本研究構建的重組質粒pET30a-Klf4在宿主菌BL21中經IPTG誘導獲得高效表達。本研究表明，1mmol/L IPTG 37℃誘導4h，表達效果較好。經可溶性分析，目的蛋白以包涵體的形式存在，用8mol/L尿素在變性條件下進行純化，結果比較滿意。但在進行His-Klf4融合蛋白的純化過程中，目的蛋白與鎳離子親和層析柱結合不穩定。針對此種情況，改變了多種條件，最終發現在裂解液中加入10％甘油并把pH調至7.4后蛋白能與鎳離子親和層析柱較好地結合，這是由于菌液進行超聲裂解之后pH有所下降，當pH在4.5-5.3時組氨酸殘基質子化，蛋白無法與鎳離子進行結合。在目的蛋白的洗脫過程中，目的蛋白洗脫量過低，洗脫液中含有大量雜蛋白。在裂解液中加入吐溫、Triton等表面活性劑，減少了雜蛋白與層析柱的非特異性結合，并且根據目的蛋白等電點（pH8.0）改變雜蛋白洗脫液pH值，最終用pH值5.0的洗脫液洗脫目的蛋白，獲得了較好的純化效果。

總之，本研究克隆了山羊Klf4基因，成功構建原核表達載體，通過誘導表達和純化獲得了山羊His-Klf4的融合蛋白，為山羊多能干細胞的研究奠定了基礎。

4 結論

利用RT-PCR方法從山羊原始生殖嵴中成功克隆了Klf4基因，構建了原核表達質粒pET30a-Klf4，通過原核表達技術成功獲得了純化的山羊His-Klf4融合蛋白。

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