甘蔗脫落酸脅迫成熟誘導蛋白基因（SoASR）的克隆和表達分析

黃杏 楊麗濤 張保青 宋修鵬 李楊瑞 王盛

甘蔗（Saccharum officenarum L.）作為我國最主要的糖料作物，起源于熱帶及亞熱帶地區，屬喜溫作物。近年來，頻發的寒害凍害對甘蔗的生產造成了巨大的損失［1-3］。脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物對逆境脅迫的防衛機制成員之一［4，5］。在逆境條件下，它與ABA結合蛋白的結合能力增強，并感知和傳遞環境信號，以啟動植物體內的應激反應，提高植物抗御各種逆境因子的脅迫能力［6-8］。在低溫脅迫過程中，內源ABA含量顯著增加，表明ABA參與植物低溫脅迫信號轉導［9，10］。目前已發現有150多種基因可受ABA的誘導，其中包括在植物器官中受環境脅迫誘導表達的基因［11］。脫落酸脅迫成熟誘導蛋白（ABA-/stress-/ripening-induced protein，ASR）是一類親水性極強的小分子熱穩定蛋白，其表達調控受脫落酸、脅迫及成熟的誘導［12］。前人關于ASR的研究主要集中在果實成熟和衰老方面［13，14］，隨著對ASR研究的不斷深入，發現它與干旱、鹽脅迫及低溫等非生物脅迫之間也存在著一定的應答關系［15-17］，但目前對此基因的研究還僅限于百合［18］、葡萄、香蕉等少數植物，且從分子角度研究甘蔗的ASR與環境脅迫間的關系鮮有報道。本課題組在前期甘蔗抗寒抗旱的蛋白質組學研究中也發現，滲透和低溫脅迫下甘蔗體內ASR蛋白的表達量發生了顯著的變化［19］。在此基礎上，本研究運用同源克隆和RT-PCR技術克隆了甘蔗脫落酸脅迫成熟誘導蛋白（ASR）基因；構建了其原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達；同時利用熒光定量PCR技術分析了ASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達模式，為進一步探索ASR基因在逆境脅迫中的生子生物學功能和甘蔗抗寒分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年3 月至2011年12 月在廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室完成。以抗寒性強的甘蔗品種桂糖28號（GT28）和抗寒性弱的甘蔗品種園林6號（YL6）作為研究材料。將兩個甘蔗品種的單芽種莖進行脫毒處理后放進沙盤中進行沙培。待甘蔗長出2-3葉時，將蔗苗從沙中移出，選取長勢一致的甘蔗苗移栽至20cm×25cm（直徑×高）的營養盆中，每盆裝混合土4kg（土∶有機肥∶沙=6∶3∶1，W/W），每盆種植2株，并把營養盆移至智能溫室大棚，按日常管理生長40d，然后轉入人工氣候室（溫度為28℃，光強為250-300μmol/m2·s，12h 光 周 期， 相 對 濕 度 60％-70％）培養10d，甘蔗長到5-6葉期時，分組進行處理。第一組處理為低溫+噴施ABA（100μmol/L ABA），記為LA；第二組處理為低溫+噴施清水，記為L（注：噴施程度以葉面噴施欲滴為度，于甘蔗苗進行低溫處理前12h噴施）。低溫處理下，溫度為0℃，光強為 250-300μmol/m2·s，12h光周期，相對濕度60％-70％。分別在處理0、1、7和14d剪取甘蔗+1葉，用液氮速冷后存于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌DH5α、凝膠回收試劑盒購自Bioer公司；Dream Taq酶、pMD18-T載體試劑盒、IPTG、X-gal、IPTG、dNTPs均購自TaKaRa寶生物工程有限公司；質粒小量抽提試劑盒購自上海生工，引物合成及測序由上海生工完成。pET-30a（+）載體和大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室保存。DNA Ligation連接試劑盒、EcoRⅠ、Hind Ⅲ 購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 甘蔗葉片總RNA提取按北京康為世紀生物科技有限公司Trizol說明書進行，cDNA合成用TaKaRa寶生物工程有限公司M-MLV逆轉錄酶，逆轉錄引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具體步驟按說明書進行，完成后取4μL PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查并用紫外分光光度計檢測cDNA 濃度，最后將各處理cDNA濃度稀釋至同一濃度。

1.2.2 SoASR 基因的克隆與生物信息學分析 以NCBI中已報道的玉米、水稻等物種的ASR 基因為參照，運用NCBI BLAST搜索其對應的核酸序列，選取同源性較高的核酸序列進行比對分析并利用DNAMAN軟件設計該基因上游簡并引物ASR：5'-ATG（T/G）C（T/C/G）（C/G）A（G/A）GAG（C/A）A（G/T）CA（C/T）CACCA-3'，下游引物為逆轉錄加尾引物 3 side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。獲得該基因全長后在其編碼框首尾設計引物F：5'-ATGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'和 R：5'-TCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTCTTC-3'進行擴增以驗證序列準確性。擴增ASR 基因的PCR體系為25μL，模板為不同處理cDNA 等量的混合樣，具體操作按照Dream Taq酶說明書進行。PCR擴增參數為：95℃預變性 5min ；95℃ 40s，58℃ 50s，72℃延伸2min，35個循環；72℃延伸8min。所有PCR產物經1.5 ％ 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶后連接pMD18-T載體（TaKaRa）后轉化DH5α（Trans Gen）感受態細胞，篩選陽性克隆，送上海生工測序。

用BioXM 2.6預測基因氨基酸序列；利用NCBI在線分析軟件檢索各基因與其他物種的同源性；用MEGA 4.0軟件構建每個基因與其他物種氨基酸序列的進化樹；在線軟件（http：//isoelectric.ovh.org/）分析基因氨基酸序列的蛋白質分子量和等電點大小；用WoLF PSORT在線軟件分析基因亞細胞定位；用SOSUI signal軟件預測基因信號肽；用ExPASy Proteomics Server在線軟件預測基因的親水性和跨膜結構；用SOPMA軟件預測基因的二級結構；用Motif Scan在線軟件分析基因蛋白質功能結構域。

1.2.3 SoASR基因的原核表達 以pET-30a（+）為表達載體，根據SoASR基因ORF，設計SoASR表達載體構建引物SoASR pET-30aF：5'-CGGAATTCA TGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'，SoASR pET-30aR：5'-CCAAGCTTTCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTC TTC -3'（下劃線部分分別為N端EcoRⅠ酶切位點和C端Hind Ⅲ酶切位點），進行PCR擴增后回收純化后和pET-30a載體分別用EcoRⅠ+Hind Ⅲ進行雙酶切，回收酶切產物，用DNA Ligation 連接試劑盒連接目的基因與載體，獲得重組質粒，轉化大腸桿菌BL21（DE3），Kan抗性篩選，進行測序和雙酶切鑒定。

將重組菌株在LB 液體培養基中37℃培養至OD600約0.4-0.6，以空載體 pET-30a（+）（BL21）為對照，加入IPTG至終濃度到1mmol/L和2mmol/L，37℃下分別誘導0、2、4和6h，收集菌液各2mL。將所收集菌液于5000r/min離心5min，棄去上清，在向沉淀中加入200μL 3×上樣緩沖液，沸水浴5min，冰上冷卻后，取20μL進行SDS-PAGE 電泳分析（SDS-PAGE 的濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12.5％）。電泳結束后用0.5％考馬斯亮藍R-250進行染色，成像分析。

1.2.4 SoASR基因的實時熒光定量表達分析 根據獲得的SoASR 基因全長序列設計熒光定量PCR特異性引物SoASR QF：5'-GAGTACACGGAGACCACGGT-3'、SoASR QR ：5'-TCTCGTAGAGTGCGAAGGC-3'，以甘蔗25S rRNA基因（BQ536525）為內參，設計內參引物25S rRNA QF：5'-GTCAGAAAAGTTACCACAGGGA-3'、25S rRNA QR：5'-GGTAAAACTAACCTGTCTCACGA-3'。熒光定量PCR反應在ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀上進行，反應體系為20μL，方法參照天根公司熒光定量試劑盒Real Master Mix（SYBR Green Ⅰ）說明書。反應參數：95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 20s，40個循環。按照2-ΔΔCT法計算出基因表達水平的相對表達量。

2 結果

2.1 總RNA提取及檢測

取4μL甘蔗葉片總RNA經1.0％凝膠瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1結果表明RNA帶型完整清晰，18S和28S兩條帶比較完整且較亮，5S則隱約可見，并無雜質污染，說明所提取的甘蔗RNA質量較好。紫外分光光度計測定，RNA的OD260/OD280值在1.85-1.95之間，OD260/OD230值在2.0-2.2之間，說明提取的總RNA 完整度和純度都較高，可進行后續試驗。

圖1 甘蔗葉片總RNA瓊脂糖檢測

2.2 SoASR 基因全長cDNA克隆

以混合甘蔗葉片cDNA為模板，用簡并引物ASR引物和3 side通用引物進行PCR擴增，擴增得到一條750bp左右的片段（圖2），經過回收、克隆和測序后在NCBI進行比對，結果為甘蔗ASR基因cDNA全長。其cDNA全長序列為753bp，包含啟始密碼子ATG和終止密碼子TAA，命名為SoASR，GenBank登錄號為JX470187。該基因cDNA序列包含一個429bp的ORF，編碼142個氨基酸，另外包含324bp的3'非編碼區，3'非編碼區還包括一個18bp ploy（A）尾巴。

2.3 SoASR基因生物信息學分析

圖2 甘蔗SoASR基因PCR擴增結果

生物信息學分析顯示，SoASR蛋白分子量大小為25.9kD，等電點為6.1。Glu、Ala的出現頻率較高，分別為19.0％和14.1％；Met、Arg頻率較低，為0.07％。亞細胞定位顯示其主要位于細胞核。該基因氨基酸序列不含信號肽，是一類可溶性蛋白，沒有跨膜區域；疏水性最小值為-5.7，最大值為4.5；該基因氨基酸序列未發現糖基化位點，含有1個Ser、2個Thr和3個Tyr磷酸化位點。該基因二級結構預測顯示：含有81個α-螺旋，占57.04％；隨機卷曲31個，占21.83％；延伸鏈15個，占10.56％；β-轉角15個，占10.56％。該基因氨基酸序列功能結構域分析表明，40-43、46-49兩個為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，72-77、2-32兩個為N-肉豆蔻酰化位點，6-13為富含組氨酸結構域，53-132為脫落酸/WDS誘導蛋白結構域（圖3）。

圖3 SoASR基因編碼區核苷酸序列及推導出的氨基酸序列

用MEGA 4.0軟件構建了甘蔗SoASR基因與其它12個物種氨基酸序列的進化樹。結果（圖4）表明，13個不同物種ASR基因被聚為4個組，草莓和鹽角草為一組，水稻單獨為一組，銀杏和云杉為一組，其余為一組，而甘蔗SoASR與大蕉、玉米和高粱聚為一小組，同源性為79％、93％和88％，說明甘蔗和玉米、高粱等的親緣關系較近。

圖4 甘蔗SoASR基因與其它物種ASR基因的氨基酸序列同源性分析

2.4 SoASR基因原核表達載體構建及誘導表達

大量提取pMD18T-SoASR和pET-30a（+）質粒并進行純化，利用EcoRⅠ+Hind Ⅲ分別進行雙酶切，回收插入目的片段和表達載體，按DNA Ligation連接試劑盒說明進行連接，獲得重組質粒pET30a-SoASR。以重組表達質粒pET30a-SoASR 為模板，PCR擴增出429bp 左右的片段，并將重組質粒陽性克隆測序，結果（圖5- A）表明插入片段與克隆序列完全一致，ORF 正確。在此基礎上，又用EcoRⅠ+Hind Ⅲ雙酶切重組質粒pET30a-SoASR，可切得約5 460bp的pET-30a（+）載體片段和429bp 左右SoASR基因片段（圖5- B），表明SoASR 基因已插入載體質粒中，SoASR基因的原核表達載體pMD18TSoASR構建成功。

將鑒定后的pET30a-SoASR和空載體pET-30a（+）轉入表達菌BL21（DE3）中，用1mmol/L和2mmol/L的IPTG進行誘導表達，表達產物SDS-PAGE電泳結果如圖6。在2 個不同濃度和不同時間的IPTG 誘導下，均能誘導出融合蛋白，而對照則沒有融合蛋白表達。在分子量約為32.0kD的位置上存在1 條融合蛋白誘導表達的條帶，與SoASR編碼蛋白分子量理論值基本相符，表明原核表達載體構建正確。

圖5 重組質粒pET30a-SoASR PCR和雙酶切驗證結果

圖6 SoASR在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE電泳圖譜

2.5 SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達分析

由圖7可知，低溫脅迫下，SoASR基因在未噴ABA處理的兩個甘蔗品種中表達趨勢不同，在GT28L中其表達趨勢為先升后降，在脅迫1d時達到最大，分別為脅迫0、7和14d的7.4倍、4.6倍和11.2倍；在YL6L中其表達呈下降趨勢，并在脅迫14d時降到最低，為0d的13.5％。加ABA處理的兩個甘蔗品種SoASR基因的表達都呈下降趨勢，在脅迫14d時降到最低，分別為未進行低溫處理前的13.5％和2.8％，相比之下，YL6LA的降幅要大于GT28。外噴ABA后，SoASR基因的表達明顯被誘導，在脅迫0d時，GT28LA為GT28L的9.6倍，YL6LA為YL6L的2.9倍。

圖7 兩個甘蔗品種SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達

3 討論

脫落酸（ABA）作為一種重要的植物應答逆境脅迫的調節因子，在植物抵御如低溫等不良脅迫反應中起著重要的作用。雖然目前大量研究證實ABA途徑及ABA誘導合成的關鍵基因受各類脅迫的影響，但ABA響應低溫脅迫的應答機制還不清楚。克隆甘蔗ASR蛋白，可為進一步研究ABA在甘蔗抗逆脅迫中的作用提供理論基礎。本研究發現，甘蔗SoASR基因雖與玉米、水稻的同源性較高但與其它物種的同源性較低，說明ASR基因在進化過程中變異較大。同時，SoASR基因氨基酸序列不含信號肽，也未有跨膜區域和糖基化位點；亞細胞定位確定其位于細胞核。有研究表明植物大約1/3 ASR定位于細胞核，其它大多數分散在細胞質中；而ASR作用主要在細胞核中，并通過核定位信號參與多個核質運輸途徑［12］。但現有研究證明，ABA參與逆境脅迫時作為信號分子功能通過ABA受體將其運到效應部位，進而誘導植物提高抗逆性［12，20］，因此，推測ASR基因是通過其氨基酸序列中的磷酸化位點，即酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點進行蛋白磷酸化來介導ABA信號轉導的，使蛋白激酶總活性增加來減少活性氧的生成，起到抗氧化防護作用［21］。通過對SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下表達的研究，發現低溫脅迫下SoASR基因在抗寒性強品種GT28中上調表達，并在脅迫1d迅速達到峰值，而在抗寒性弱的品種YL6中卻一直表現為下調表達。推測SoASR基因可能在甘蔗抗寒過程中發揮了信號傳導作用，進而能將更多的信號傳送出去，通過蛋白質磷酸化參與ABA誘導下游基因表達，從而起到保護作用［22，23］；而在YL6中表達的下調，也就阻礙了其信號轉導和下游基因的表達調控，從而表現出低抗寒力。外噴ABA處理后，SoASR基因在兩個甘蔗品種中的表達都明顯上調，這樣可加強ASR基因通過磷酸化和去磷酸化來介導ABA信號傳導途徑，提高甘蔗自身抗氧化防護的能力。這在草莓上也有相似的報道［24］。由此可見，SoASR基因與甘蔗的抗寒性密切相關，下一步將通過抗體制備和轉基因等方面的研究，進一步探討SoASR基因在甘蔗低溫脅迫中的作用機制。

4 結論

采用同源克隆和RT-PCR技術克隆了甘蔗SoASR 基因全長429bp的完整編碼序列，GenBank登錄號為JX470187，編碼142個氨基酸的蛋白。原核表達結果表明該基因以融合蛋白形式表達，相對分子量約為32.0kD。結果表明，低溫脅迫下該基因在抗寒性不同的品種中表達特性不同，但在抗寒性不同的品種中該基因的表達都受ABA的誘導，推測SoASR 基因在甘蔗抗寒機制中發揮某種作用。

［1］ 李楊瑞, 方鋒學, 吳建明, 等.2010/2011榨季廣西甘蔗生產凍害調查及防御對策［J］.南方農業學報, 2011, 42（1）：37-42.

［2］ 李楊瑞, 楊麗濤.20世紀90年代以來我國甘蔗產業和科技的新發展［J］.西南農業學報, 2009, 22（5）：1469-1476.

［3］ 鄧展云, 劉海斌, 張革民, 等.2007/2008年榨季廣西甘蔗霜凍發生危害規律的調查［J］.中國糖料, 2009（1）：47-50.

［4］ Huang D, Wu W, Abrams SR, et al.The relationship of drought related gene expression in Arabidopsis thaliana tohormonal and environmental factors［J］.Journal of Experimental Botany, 2008, 59：2991-2997.

［5］ Depuydt S, Hardtke CS.Hormone signalling crosstalk in plant growth regulation［J］.Current Biology, 2011, 21：R365-R373.

［6］ Shen YY, Wang XF, Wu FQ, et al.The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor［J］.Nature, 2006, 443：823-826.

［7］ Boneh U, Biton I, Schwartz A, et al.Characterization of the ABA signal transduction pathway in Vitis vinifera［J］.Plant Science,2012, 187：89-96.

［8］ Raghavendra AS, Gonugunta VK, Christmann A, et al.ABA perception and signalling［J］.Trends in Plant Science, 2010, 15：395-401.

［9］ 江玲, 侯名語, 劉世家, 等.水稻種了低溫萌發生理機制的初步研究［J］.中國農業科學, 2005, 38（3）：480-485.

［10］ 王興, 于晶, 楊陽, 等.低溫條件下不同抗寒性冬小麥內源激素的變化［J］.麥類作物學報, 2009, 29（5）：827-831.

［11］ 王磊, 趙軍, 范云六.玉米Cat1基因順式元件ABRE2結合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析［J］.科學通報, 2002, 47（15）：167-171.

［12］ Yang CY, Chen YC, Jauh GY, et al.A lily ASR protein involves abscisic acid signaling and confers drought and salt resistance in arabidopsis［J］.Plant Physiology, 2005, 139：836-846.

［13］ Fernando C, Alisdair RF, Norberto DL.Heard it through the grapevine? ABA and sugar cross-talk：the ASR story［J］.Trend in Plant Science, 2004, 9（2）：57-59.

［14］ Rossi M, Carrari F, Cabrera PC, et al.Analysis of an abscisic acid（ABA）-responsive gene promoter belonging to the Asr gene family from tomato inhomologous andheterologous systems［J］.Mol Gen Genet, 1998, 258：1-8.

［15］ Maskin L, Gubesblat GE, Moreno JE, et al.Differential expression of themembers of the Asr gene family in tomato（Lycopersicon esculentum）［J］.Plant Sci, 2001, 161：739-746.

［16］ Jeanneau M, Gerentes D, Foueillassar X, et al.Improvement of drought tolerance inmaize：towards the functional validation of the ZM-ASR1 gene and increase of water use efficiency by overexpressing C4-PEPC［J］.Biochimie, 2002, 84：1127-1135.

［17］ Kalifa Y, Gilad A, Konrad Z, et al.The water- and salt-stress regulated Asr1 gene encodes a zinc-dependent DNA- binding protein［J］.Biochem J, 2004, 381：373-378.

［18］ Huang JC, Lin SM, Wang CS.A pollen-specific and desiccationassociated transcript in Lilium longiflorum during development and stress［J］.Plant Cell Physiol, 2000, 41：477-485.

［19］ Zhou G, Yang LT, Li YR, et al.Proteomic analysis of osmotic stress-responsive proteins in sugarcane leaves［J］.Plant Mol Biol Rep, 2012, 30（2）：349-359.

［20］ Cakir B, Agasse A, Gaillard C, et al.A grape ASR protein involved in sugar and abscisic acid signaling［J］.Plant Cell, 2003, 15（9）：2165-2180.

［21］ 許樹成, 丁海東, 魯銳, 等.ABA在植物細胞抗氧化防護過程中的作用［J］.中國農業大學學報, 2008, 13（2）：11-19.

［22］ 許樹成, 祝雪蘭, 張麗.蛋白激酶組在玉米葉片ABA 和H2O2誘導抗氧化防護中的作用［J］.植物分類與資源學報, 2011,33（3）：275-286.

［23］ 吳忠義, 陳伽, 朱美君.脫落酸（ABA）受體的研究進展［J］.植物學通報, 1998, 15（4）：36-40.

［24］ 劉雅萍, 張希, 葛安靜, 等.草莓ABA 結合蛋白基因的克隆及序列分析［J］.中國農學通報, 2011, 27（10）：260-265.