畢赤酵母高效表達整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶

薛沖沖 張俊輝 林影 韓雙艷

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），指一系列能在油-水界面水解三酯酰甘油的酶類。其中米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucormiehei lipase，RML）是一種重要的、有代表性的脂肪酶，它可以催化酯水解、酯合成、酸解、醇解、氨解、內酯化、轉酯化等多種類型的反應［1］。由于RML具有獨特的催化結構，并且能顯示高度的底物1，3位置專一性［2］，使其相對于其他一些工業脂肪酶，如南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）具有更好的底物選擇性和特異性。因此其在油脂、制藥、香精香料、化工等領域有著重要的應用價值［3］。

畢赤酵母表達系統具有可進行高密度發酵、表達量較高、對蛋白質進行修飾、糖基化程度低等優點，應用該系統成功地表達了大量的外源蛋白［4，5］。本實驗室也將RML在畢赤酵母中進行了表達，但是其表達量比較低，造成生產成本較高，和商業化酶相比仍有較大的差距。因此有必要提高RML在畢赤酵母中的表達水平，降低其成本和價格，促進其工業化大規模使用。

2004年 Ahn等［8］將來源于哈茨木霉內切葡聚糖酶II（THEGII）的CBD與嗜熱脂肪芽孢桿菌的L1脂肪酶在釀酒酵母中融合表達，融合蛋白CBDLinker-L1Lipase相比較L1-Lipase的分泌量會顯著提高7倍。故本研究嘗試通過該CBD與RML在畢赤酵母中進行高效的融合表達，以期獲得高酶活力的RML，為進一步的降低應用于工業生產的RML的生產成本，有目的改善RML的相關酶學性質奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 Pichia pastoris GS115、菌株E.coli Top10F'由本實驗室保存，重組質粒pPICZαA-RML由本實驗室構建、pUC57-CBD-L由金斯瑞生物科技有限公司合成，質粒 pPICZαA 購自Invitrogen公司。

1.1.2 培養基 LB培養基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化鈉，根據需要添加100mg/mL博來霉素，終濃度為25μg/mL。培養基YPD、 MD、BMGY、 BMMY配方參考Invitrogen公司操作手冊。

1.1.3 試劑 酵母氮源YNB（Yeast Nitrogen Base）、蛋白胨均購Difco公司；酵母抽提物購自Oxford公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和限制性內切酶購自TaKaRa公司，其他試劑均為市售國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設計 為了獲得相應的目的基因片段 CBD和RML需設計特異性的引物進行擴增。其中擴增來源于 THEGII的目的片段 CBD 使用模板pUC7-CBD，上游引物 CBDp1：CCGGAATTCCAGCAGACAGTTTG，含 EcoR I 酶切位點（以下劃線示出）及保護堿基；下游引物 CBDp2：ATAACCGCGGTGATGAGGTTG，含 Sac II 酶切位點（以下劃線示出）及保護堿基。擴增RML基因使用模板 pPICZαARML，上游引物 RMLp1：ATAACCGCGGGTTCCAATTAAGAGACAAT，含Sac II 酶切位點（以下劃線示出）及保護堿基；下游引物RMLp2：ATTATTGCGGCCGCTAGTACACAAACCAGT，含Not I 酶切位點（以下劃線示出）及保護堿基。引物合成由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

1.2.2 CBD-RML的克隆 以pUC7-CBD為模板，CBDp1和CBDp2為引物進行PCR擴增目的片段CBD，反應體系為模板 1μL；primerstar HS為 25μL；20mmol/L 的上下游引物各 1μL，加無菌水至總體積為 50μL。反應條件為：98℃預變性 5min；98℃變性 15s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，共25 個循環；第25 個循環，72℃延伸5min。同理，以pPICZαA-RML為模板，RMLp1和RMLp2為引物進行PCR擴增目的片段RML，反應體系和反應條件同上。所獲得的PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化。

1.2.3 重組質粒pPICZαA-CBD-RML（簡稱“pPICZ-αA-CRML”）的構建 當構建重組質粒pPICZαACRML時，將PCR產物CBD用EcoR I和Sac II雙酶切，RML用Sac II和Not I雙酶切，同時將質粒pPICZαA用EcoR I和Not I雙酶切，在T4連接酶的作用下構建重組質粒pPICZαA-CRML，然后用 CaCl2轉化法轉入 Top10F'，在 Zeocin+的 LB（25μg/mL）平板上涂板，過夜培養。提取陽性轉化子質粒，對pPICZαA-CRML進行EcoR I和Not I 雙酶切鑒定；鑒定正確后，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.2.4 重組畢赤酵母的構建 通過 LiCl 法將Sac I 線性化的重組質粒pPICZαA-CRML轉化宿主菌GS115轉化物涂布于YPDS（Zeocin+）平板上，30℃培養2-3d。

我國確立和推進社會主義市場經濟以來，中央和地方政府的經濟立法始有成效，但對保護支持中小企業的立法仍有欠缺。2002年我國發布《中小企業促進法》，啟動了保護支持中小企業發展的立法。2017年第十二屆全國人民代表大會常務委員會第29次會議修訂通過《中小企業促進法》，從2018年1月1日起開始實施。修訂后的《中小企業促進法》著力解決中小企業負擔重、融資難和人才缺乏等具體問題，使保護支持中小企業健康發展的法律作用上了一個新臺階。但除了全國人大的立法，地方人大因地制宜的立法也是不可或缺的。由于地方政府受財力物力或其他因素制約，對地方立法支持小微企業缺乏主動性，以至這方面的立法比較滯后。

1.2.5 畢赤酵母重組菌株產重組米黑根毛霉脂肪酶酶的水解平板檢測 挑取在 YPDS（Zeocin+）平板上正常生長的陽性轉化子，轉接到MD平板上，30℃培養 2-3d。然后挑取水解圈較大的轉化子進行搖瓶發酵試驗。

1.2.6 重組轉化子的鑒定及搖瓶培養 經過水解平板篩選后，從MD平板上挑取水解圈較大的陽性轉化子進行搖瓶培養，并命名為GS115/pPICZαACRML；同時以重組菌GS115/pPICZαA-RML為陽性對照進行搖瓶發酵試驗。

將不同菌株分別接種于 25mL BMGY 培養基中，30℃，250r/min 振蕩培養約 40h 至 OD600到 25-30。離心收集菌體，再將其懸浮于 25mL BMMY 培養基中，繼續振蕩培養，每隔24h 向 BMMY 培養基中補加甲醇至終濃度為2.0％進行誘導。

1.2.7 重組脂肪酶的酶活測定 以對硝基苯基辛酸酯最為重組脂肪酶CR和RML的最適底物，利用pNPC法測定發酵上清液中脂肪酶的活力［9］。酶活單位（U）定義為：每分鐘水解底物生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.2.8 表達產物的SDS-PAGE 分析 重組轉化子GS115/pPICZαA-CRML 和 對 照 菌 GS115/pPICZαARML誘導培養 120h，取發酵上清液 50μL，以 20μL 上樣，進行 12％ SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍R250 染色，檢測目的蛋白的表達。

2 結果

2.1 重組質粒pPICZαA-CRML的構建

構建重組質粒pPICZαA-CRML，經雙酶切鑒定（圖1）顯示目的片段大小約為1200bp（含210bp前導肽序列），重組質粒測序結果顯示插入片段大小為1233bp，與擬克隆的CRML序列一致，且讀碼框正確。

2.2 重組轉化子的三丁酸甘油酯MM平板鑒定篩選

將構建好的重組質粒進行畢赤酵母轉化試驗，所獲得的重組轉化子接種于 MM平板（混合三丁酸甘油脂），倒置培養皿，在蓋上涂 100μL甲醇，30℃誘導培養 72h后，重組轉化子相對于陽性對照菌GS115/pPICZαA-RML，在菌落周圍均能產生較大的透明圈，說明重組轉化子能夠有效地分泌脂肪酶，圖2所示為MM平板上其中一個重組轉化子（GS115/pPICZαA-CRML）和陽性對照菌（GS115/pPICZαARML）的水解圈比較，GS115/pPICZαA-CRML周圍的水解圈要明顯大于GS115/pPICZαA-RML。

圖1 重組質粒pPICZαA-CRML的雙酶切鑒定

圖2 三丁酸甘油酯 MM板檢測酵母重組菌

2.3 CBD-RML 和RML在畢赤酵母中的表達

將篩選獲得的重組酵母和對照菌進行搖瓶培養，添加終濃度2％的甲醇誘導，每隔24h取樣，檢測重組酶酶活力和OD600值，結果（圖3，圖4）表明，在甲醇誘導的120h期間，GS115/pPICZαA-RML的生長狀況明顯好于重組菌GS115/pPICZαA-CRML，可能是由于外源基因的加入，宿主菌表達新基因需要消耗更多的資源，導致宿主菌代謝負擔增加，從而影響重組菌的生長。當整合哈茨木霉的CBD到RML的N-末端后，重組酶CRML的酶活力整體比RML要高，甲醇誘導發酵產酶96h時，CRML相對RML酶活提高了近16.7％，分析可能是CBD的加入提高了融合蛋白的分泌量。

當甲醇誘導120h時，分別取以上發酵上清液20μL上樣進行10％ SDS-PAGE考馬斯亮藍R250染色，結果（圖5）顯示，重組菌誘導表達后，整合有CBD的重組脂肪酶CRML分子質量要略高于RML（30kD），而且重組酶CRML蛋白濃度要明顯高于RML，與發酵數據基本一致，即因為CBD整合到RML中，導致重組酶CRML的分泌量提高，進而在SDS-PAGE分析結果顯示出重組酶CRML的蛋白條帶濃度高于RML的現象。

圖3 兩種重組畢赤酵母的發酵生長曲線

圖4 兩種重組畢赤酵母產酶曲線

圖5 兩種重組酵母發酵上清液的SDS-PAGE

2.4 CRML 和RML的酶學性質

在 pH值 8.0的磷酸緩沖液中配制底物，分別在不同反應溫度下進行酶促反應，在 30-60℃內溫度曲線見圖 6。由圖6可知，RML在45℃時酶活力最高，而重組脂肪酶CRML的最適溫度為50℃，并且在45-60℃范圍內均有超過60％的酶活力。

酶的熱穩定測定時，將酶置于65℃時保溫，每隔2min取樣測酶活力，并繪制酶的熱穩定性曲線，由圖7可知，兩者酶的熱穩定性曲線基本類似，隨著時間的延長兩者的熱穩定性逐漸下降，反應到第8min時，CRML的相對酶活力降到僅剩7.5％，而RML的相對酶活力也只剩11％。

3 討論

當前，微生物脂肪酶至投入工業生產20多年來，其應用領域相當廣泛，包括食品工藝、造紙業、精細化學品合成業、化妝品制造業和制藥等行業中，一直是酶學研究領域的熱點，米黑根毛霉脂肪酶RML正是這樣一種在各行業中具有潛在應用價值的酶，但是關于對RML酶活改進的文章報道還比較少，Zhang等［10］嘗試將RML在釀酒酵母表面進行展示表達發現，其酶活力比較低，只有280U/L。但在實際的生產過程中，RML的應用出現了急需解決的兩個主要問題：第一，較高的成本投入；第二，酶的穩定性和酶活力較差。

CBD在蛋白質工程的應用是個新的領域，許多研究表明當將CBD與異源蛋白融合表達時，大部分可以提高融合蛋白的表達量。Johanna等［11］研究了CALB和融合CBD（CBM第一家族）的CALB在以甲醇為誘導的畢赤酵母中功能性的表達，該CBD來自于厭氧性瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的纖維素酶A。研究結果顯示，分泌到培養基的重組蛋白（CBD-CALB）水平近25mg/L，CBD-CALB和CALB相比有相似的比活力，且CBD-CALB吸附纖維素的能力遠大于CALB。Sarath等［12］將來源于里氏木霉纖維二糖水解酶（CBHII）的CBD（CBM第二家族）融合到Saccharomycopsis Wbuligera的β-葡糖糖苷酶（BGL1）中并以釀酒酵母作為表達宿主菌，結果表明，整合CBD的融合蛋白對纖維素的水解能力提高了2-4倍，其中融合一個CBD的蛋白比融合兩個CBD蛋白水解纖維素能力更強。另外Ahn等［8］將THEGII的CBD（CBM第一家族）與嗜熱脂肪芽孢桿菌的L1脂肪酶在釀酒酵母中融合表達后，相比較L1-Lipase，融合蛋白CBD-Linker-L1Lipase的分泌量會顯著提高7倍。本研究通過將THEGII的CBD融合到RML上后，融合蛋白CRML的表達量也有一定程度的提高，達到17％。該CBD能促進異源蛋白表達量的提高可能原因是CBD含有異源蛋白不具有的二硫鍵結構，而這種二硫鍵結構有助于融合蛋白穩定性的提高，從而阻止因與一些硫醇氧化還原酶的接觸導致融合蛋白聚沉［8］。本研究中的融合蛋白CRML酶活力相比較單一的RML卻只提高了17％，這可能與不同的融合酶在不同的宿主菌中表達有關系。

圖6 溫度對重組脂肪酶CRML和RML的酶活影響

圖7 重組脂肪酶CRML和RML的熱穩定性測定（65oC）

另外，融合蛋白CRML相比較RML，其最適溫度提高了5℃，并且兩者具有相似的熱穩定性曲線。為了滿足苛刻的工業生產條件，研究了65℃ 時兩種酶的熱穩定性曲線，結果表明CRML和RML在保溫2min中后，兩者相對酶活均下降超過50％，說明如何能提高RML的熱穩定性也是當前的研究重點。在相關報道中，Ravalason等［13］將來源于黑曲霉纖維二糖水解酶的第一家族CBM融合到Pycnoporus cinnabarinus的漆酶上后，融合蛋白的最適溫度相對于原始漆酶有一定程度的提高，但熱穩定性卻有所下降；Shin等［14］通過將 Clostridium stercorarium 木聚糖酶中的木聚糖結合域從催化域的N-末端轉移到C-末端，改造后重組酶的最適溫度下降了35℃。當增加CBM融合到不同的水解酶上后，能夠引起這些水解酶的最適溫度或熱穩定性的各種改變，因此，很難去預測CBM的加入會對某種酶的最適溫度或熱穩定性的絕對變化。

基于米黑根毛霉脂肪酶RML的低酶活力，生產高成本等缺陷，并在食品、化工等領域的廣泛應用前景，本研究嘗試將來源于哈茨木霉的CBD整合到RML的N端并在畢赤酵母中高效表達，相比單一的RML，重組酶的酶活力最高提高了17％。獲得的高活力重組脂肪酶不僅為其在工業生產中應用降低成本奠定基礎，同時為人們探究CBD如何影響RML的相關酶學性質提供一定的理論依據。

4 結論

本研究成功構建了分泌型的重組質粒pPICZαACRML，實現了整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶CRML在畢赤酵母GS115中的高效表達，同時對RML和CRML的相關酶學性質進行了比較。結果顯示，RML和CRML具有相似的最適溫度和溫度穩定性曲線，兩者的最適作用溫度分別為45℃和50℃；相比較RML，融合蛋白CRML在畢赤酵母中的表達分泌量提高了近17％，說明來源于THEGII 的CBD可以作為異源蛋白在畢赤酵母中表達的分泌增強子。

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