PDGF-GAL真核表達載體的構建及細胞表達

榮曼 張銳虎 劉田福

甘丙肽是一種廣泛分布外周和中樞神經系統的神經肽，研究發現，它具有調節胰腺分泌，促進食欲，抑制脂肪組織中抵抗素基因的表達，影響胃腸蠕動，提高垂體生長激素，催乳素，促黃體生成激素釋放等功能，尤其在學習，記憶，痛覺和脊神經反射等神經功能方面發揮重要作用。國外不僅利用外源甘丙肽，甘丙肽拮抗或者激動劑深入研究甘丙肽在神經組織和外周的作用，并且已成功建立了甘丙肽過表達的轉基因小鼠［1］；國內也在甘丙肽對阿爾茨海默癥，抑郁癥，癲癇等的影響方面取得了很大進展，但仍缺乏內源性過表達的甘丙肽用于進一步的疾病模型研究。本課題將延用本實驗室已有的科研成果——重組克隆質粒pUC18-PDGF-GAL［2］，以其為模板，利用PCR技術擴增目的片段PDGF-GAL，然后將其定向克隆至真核表達載體pcDNA 3.1獲得重組表達質粒pcDNA-PDGF-GAL，采用脂質體法將重組質粒瞬時轉染神經母細胞瘤細胞實現甘丙肽基因的過表達，為下一步經G418篩選獲得穩定細胞克隆從而深入研究過表達甘丙肽的相關作用機制做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 N-2a購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.1.2 菌株和質粒 pcDNA3.1，由本實驗室所保存，大腸桿菌DH5α，pMD19-T simple vector均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試劑和培養基 DNA A-Tailing Kit，RT-PCR Kit，RNAiso Reagent均購自寶生物工程（大連）有限公司；Bgl II和Xho I限制性內切酶購自NEB公司；Plasmid Mini Kit 購自Omega公司；澳洲血源特級胎牛血清購自北京元亨金馬生物技術開發有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；小鼠甘丙肽ELISA試劑盒48T購自上海，屬進口分裝。

1.1.4 主要引物 常規PCR引物、RT-PCR均參照GenBank中GAL基因和cDNA的標準序列，使用Primer Premier5.0，Oligo6.0軟件進行設計分析，PCR正向引物 F：5'-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCTGAGTA-3'，反向引物 R：5'-CCGCTCGAGCAGTCCCAGATACTTGCTAG-3'；RT-PCR正向引物F：5'-GCAGTAAGCGACCATCCAGC-3'，反向引物 R：5'-AGGACACACGTGCACAGTGG-3'；內參正向引物F：5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，反向引物R：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段PDGF-GAL的擴增 以pUC18-PDGF-GAL質粒為模板，PCR獲得5'端具有Bgl II酶切位點，3'端具有Xho I酶切位點的目的片段。

1.2.2 重組質粒pMDT-PDGF-GAL的構建 膠回收目的片段，經加A反應，與T載體經T4連接酶16℃過夜連接，并以線性T載體自連為陰性對照，連接摩爾比為3∶1，經轉化感受態大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，擴大培養等過程，對提取的質粒進行PCR法，酶切鑒定后經測序終獲得pMDT-PDGFGAL。

1.2.3 GAL特異性表達質粒的構建 取最終測序正確的質粒pMDT-PDGF-GAL和pcDNA3.1分別用Bgl II和Xho I酶雙酶切后經T4連接酶16℃過夜連接，并以線性化pcDNA3.1和pMDT-PDGF-GAL自連為陰性對照，轉化感受態大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，擴大培養等過程，對提取的質粒進行PCR和酶切鑒定后再送交測序中心，將最終鑒定正確的重構質粒命名為pcDNA-PDGF-GAL。

1.2.4 細胞的復蘇、傳代及凍存 從液氮中取出凍存細胞立即放入40℃水浴，震蕩使其快速溶解1min，然后移入含有9mL完全培養基的離心管中，室溫下1200r/min離心吹吸混勻后移入培養瓶中繼續培養。N-2a細胞用全血清DMEM培養液（10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素）在75cm2培養瓶中附壁生長培養，細胞達到80％融合時以1∶3進行傳代。選第3-6代細胞以2×107進行凍存，凍存前一日更換新鮮培養基，凍存液含20％胎牛血清，5％ DMSO，凍存過程：4℃ 20min，-20℃ 30min，-80℃過夜后投入液氮長期保存。

1.2.5 細胞增殖率的測定（MTT法）細胞以1×103/孔接種于96孔板后分別在培養24、48、72、96、120和144h 后進行MTT檢測。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，在CO2細胞培養箱內繼續孵育4h，終止培養，小心吸去孔內培養液（注意勿吸出孔板內結晶），然后每孔加入150μL DMSO，室溫下將培養板置于微孔板振蕩器振蕩10min，置于酶聯檢測儀于570nm處檢測各孔吸光度值，以空白孔調零，繪制細胞生長曲線［3］。

1.2.6 細胞轉染 細胞瘤細胞生長匯合率為70％時收獲細胞，轉入兩個6 孔板，培養至80％以上匯合時分成兩組，陽性轉染組（脂轉pcDNA3.1-PDGFGAL質粒轉入N-2a細胞）：6 孔板中隨機抽取4孔，分別標記為第①、②、③和④孔，每孔加完全培養基2mL、含脂質體2000 10μL的DMEM培養基250μL、含GAL重組質粒4.0μg的DMEM培養基250μL；陰性對照組（脂轉pcDNA3.1質粒轉入N-2a細胞）：6 孔板中任選孔分別標記為第⑤，⑥，⑦和⑧孔，每孔加完全培養基2mL、含脂質體2000 10μL的 DMEM 培養基 250μL、含 PcDNA3.1 質粒 4.0μg的DMEM培養基250μL；空白對照組：6孔板中其余孔分別標記為*，每孔加DMEM培養基2.25mL、含Lipofectamine 2000 脂質體10μL的DMEM培養基250μL。6孔板置于37℃、5％ CO2、90％濕度條件下脂轉4h后更換為完全培養基。

1.2.7 細胞轉錄水平的鑒定 分別在轉染后24、48和72h Trizon法提取不同組細胞總RNA，用紫外可見分光光度計檢測定RNA的濃度為0.48μg/μL，純度為2.0，然后以內參GAPDH為標準進行RT-PCR，25μL的 PCR 反應體系包括 cDNA 2μL，10×PCR緩沖液 5μL，10mmol/L 各類 dNTP 3μL，2.5 U Taq DNA合成酶，GAL及GAPDH正、反向引物各2μL，RNase Free dH2O加至反應物總量50μL。輕柔吹吸混勻并短暫離心收集附壁液體后，將樣本置入PCR熱循環儀，開始PCR反應，反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性 30s，64℃退火1min，72℃延伸30s，35個循環。最后于72℃終延伸，10min。所有的標本重復測定3次。在擴增終點取5μL的產物，進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。凝膠圖像分析系統進行條帶光密度掃描，以GAPDH校正做GAL相對表達量分析。

1.2.8 酶聯免疫吸附測定（Enzyme link immunosorbent assay，ELISA）檢測GAL水平 參照 ELISA試劑盒的產品說明書進行操作，分別測定不同時間段培養上清液GAL表達水平，ELISA測定時同時設空白孔、標準孔、待測樣品孔，嚴格參照產品說明書操作后用酶標儀在 450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值），根據標準曲線計算出上清液GAL水平，結果以ng/mL或ng/mg蛋白表示。

1.2.9 統計學處理 試驗中所有數據均采用SPSS13.0軟件進行統計處理，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒pMDT-PDGF-GAL的鑒定

常規PCR，電泳鑒定PCR產物與目的片段PDGF-GAL理論大小2 896bp相符（圖1）。與T載體連接后重組質粒的酶切鑒定，超螺旋質粒大小4000bp左右，單酶切線性化質粒在5 500bp左右，與理論值5 588bp相符，雙酶切結果由于目的片段和T載體骨架大小相似，差100bp左右，雙酶切鑒定結果不易分辨（圖2）。

圖1 以重組T載體為模板的PCR電泳圖

圖2 重組T載體經單酶切和雙酶切后電泳圖

2.2 重組表達質粒pcDNA-PDGF-GAL的鑒定

常規PCR，電泳鑒定PCR產物與目的片段PDGF-GAL理論大小2 896bp相符；與質粒pcDNA3.1骨架連接后重組質粒的酶切鑒定，其中環狀質粒大小約為6000bp，重組質粒單酶切線性化后理論大小為7 500bp，pcDNA3.1經雙酶切后的骨架大小為4 600bp，目的片段PDGF-GAL大小在3000bp左右（圖3）。測序結果與理論上的重組片段進行比對，相似性達到99％。

2.3 N-2a細胞生長曲線的繪制

由圖4可知接種后48h后即圖示第2天細胞數明顯比接種后24h時顯著減少（P＜0.05），又經過一定潛伏適應期后進入對數生長期，接種后第6天后細胞漸趨于生長穩定。另外本試驗也曾嘗試6孔板和12孔板等以不同密度接種，無論臺盼藍染色計數或者MTT法測定均顯示接種后48-60h細胞活力較差，說明N-2a細胞對培養環境的改變較敏感，鑒于N-2a細胞的生長特點，轉染試驗適合于在細胞以一定密度接種后3-5d生長活力相對旺盛的時候進行以獲得最佳轉染效果。

圖3 重組表達載體經單酶切和雙酶切后電泳圖

圖4 N-2a細胞生長曲線

2.4 脂質體法轉染后不同時間段GAL轉錄水平的鑒定

轉染后48h細胞中GAL瞬時表達量最多，并且凝膠圖像分析系統進行條帶光密度掃描（圖5，圖6），以 GAPDH 校正做GAL相對表達量統計分析后與轉染后24h和72h GAL的表達量以及與對照組GAL表達量具有顯著差異（P＜0.05），以空質粒轉染后48h細胞中GAL表達量與對照組表達量沒有統計學差異（P＞0.1）。

2.5 脂質體法轉染后不同時間段GAL表達水平的鑒定

瞬轉后隨著時間的增長細胞上清中GAL表達量明顯增加，與對照未轉染組上清GAL表達量具有顯著性差異（P＜0.05），見圖7。

圖5 48h后GAL RT-PCR結果

圖6 不同時間GALRT-PCR結果

圖7 ELISA法測定瞬轉后不同時間上清中GAL蛋白含量

2.6 瞬時轉染后過表達甘丙肽對細胞形態的影響

脂質體法轉染細胞后72h后倒置顯微鏡下觀察到有一部分明顯分化趨勢的細胞，個別已近似神經元形態（圖8）。

3 討論

甘丙肽是近幾年來倍受研究者關注的一個基因，其功能是通過GAL受體GALR1、GALR2、GALR3中的一個或多個介導的，由此研究者從甘丙肽與其不同受體及其它物質的相互作用著手，深入研究其與各種疾病的聯系。在阿爾茨海默癥病人腦組織檢測到過量的甘丙肽，低于正常水平的α促黑色素細胞激素，說明甘丙肽和α促黑色素細胞激素參與調節記憶過程［4］，不僅僅在神經系統，研究者在皮膚肉芽組織形成過程中檢測甘丙肽和甘丙肽受體的表達，并證實一些甘丙肽是由成纖維細胞樣細胞所釋放［5］。總而言之，甘丙肽及其相關蛋白在機體生理或病理狀態下的作用是廣泛而復雜的。

圖8 空質粒轉染組與GAL過表達試驗組細胞圖像（10×）

本試驗成功構建了由神經特異性啟動子PDGF-β驅動GAL靶向神經組織特異性表達的真核表達載體pcDNA-PDGF-GAL，測序正確后脂質體法瞬時轉染小鼠神經母細胞瘤細胞N-2a，分別于轉染后不同時間從轉錄水平和表達水平檢測GAL的過表達情況。轉染試驗中通過繪制細胞生長曲線獲得細胞生長活力最佳時期，嚴格按照轉染試劑說明書步驟操作及依照相關文獻通過調節配制核酸脂質體復合物所用的培養基pH等［6］措施，以攜帶增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體pEGFP-N1進行轉染預試驗從而獲得轉染試驗最優化參數，最終實現GAL在N-2a的過表達。

另外，細胞轉染后72h倒置顯微鏡下觀察到有一部分明顯分化趨勢的細胞，個別已近似神經元形態，文獻中曾報道外源性甘丙肽有促進已分化的神經干細胞神經突生長的作用［7］。但是，至于本試驗中所觀察到的現象是否說明內源性甘丙肽過表達后會促進N-2a的分化，以及可能的促神經突生長作用有待進一步通過外源甘丙肽干預N-2a細胞等試驗來證實。

4 結論

本試驗成功構建了由PDGF-B啟動子驅動GAL靶向神經細胞特異性表達的真核表達載體pcDNAPDGF-GAL，并采用脂質體法瞬時轉染N-2a最終實現了甘丙肽的過表達，為進一步穩定轉染細胞系的獲得及甘丙肽生理病理等功能的研究奠定了一定的試驗基礎。

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